腺相關(guān)病毒介導(dǎo)β-NGF基因轉(zhuǎn)染大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞及其對增殖的影響.pdf

1、隨著工業(yè)化程度的提高，我國脊髓損傷發(fā)病率呈逐年上升趨勢，每年有數(shù)以萬計的人因脊髓損傷致殘。但脊髓損傷的治療至今缺少有效措施，損傷后神經(jīng)修復(fù)一直是未能解決難題。目前基因治療已成為治療疾病的新趨勢，為許多難治性疾病的治療帶來了新思路，選擇合適的細(xì)胞、基因及載體是基因治療的關(guān)鍵。
　　本實驗將促進(jìn)新生血管形成的內(nèi)皮祖細(xì)胞、促進(jìn)受損神經(jīng)再生修復(fù)的神經(jīng)生長因子和安全可靠的腺相關(guān)病毒載體三者結(jié)合，完成了腺相關(guān)病毒介導(dǎo)β神經(jīng)生長因子基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮

2、祖細(xì)胞，證實轉(zhuǎn)染β神經(jīng)生長因子基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞可持續(xù)表達(dá)β神經(jīng)生長因子，且轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)。為下一步利用攜帶β-NGF基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)提供了實驗基礎(chǔ)。
　　目的:
　　利用重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)β-NGF基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞，觀察目的基因β-NGF的表達(dá)情況及對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響，探討攜帶β-NGF基因的骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞應(yīng)用于基因-干細(xì)胞移植治療的可行性。
　　方法:

3、　　使用密度梯度離心法從大鼠骨髓分離單個核細(xì)胞，利用專用培養(yǎng)液EGM-2MV誘導(dǎo)培養(yǎng)出大鼠骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞，免疫熒光檢測技術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記分子(VEGFR2、CD133、CD34)以鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞。使用構(gòu)建的攜帶β-NGF基因的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-GFP-β-NGF)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，計算轉(zhuǎn)染效率。利用ELISA法在蛋白水平檢測β-NGF的表達(dá)情況。MTT法檢測目的基因?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性的影響。

4、
　　結(jié)果:
　　成功從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)出內(nèi)皮祖細(xì)胞，免疫熒光檢測顯示特異性表面抗原CD34、CD133和VEGFR2呈陽性染色反應(yīng)，鑒定符合內(nèi)皮祖細(xì)胞特征。β-NGF基因成功轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染率為65.30％。rAAV-GFP-β-NGF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測到β-NGF的表達(dá)，且可持續(xù)10d。而空白組正常內(nèi)皮細(xì)胞和空載病毒轉(zhuǎn)染組內(nèi)皮祖細(xì)胞未檢測到β-NGF的表達(dá)。MTT檢測顯示，rAA