HGF基因促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的體外研究.pdf

1、目的：
　　 體外條件下從大鼠骨髓中分離出單個(gè)核細(xì)胞，使用專用的培養(yǎng)基使其向內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)分化生長(zhǎng)，并將HGF基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液中HGF的表達(dá)及HGF基因?qū)υ囵B(yǎng)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移及血管形成能力的影響。
　　 方法：
　　 1.取4-6周齡Wistar大鼠(120-150g)雙下肢股骨及脛骨骨髓，利用

2、密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，并使用內(nèi)皮系專用培養(yǎng)液EGM-2MV誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其分化為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。通過倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞攝取DiL-acLDL，結(jié)合FITC-UEA-1，從功能角度鑒定細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)測(cè)定細(xì)胞表面抗原CD133、flk-1、VE-cadherin(CD144)及CD31進(jìn)一步鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 2.提取和擴(kuò)增pCMV-HGF質(zhì)粒，以缺陷性

3、腺病毒(Ad-GFP)為載體介導(dǎo)HGF基因轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率；采用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HGF蛋白的表達(dá)情況；用MTT法檢測(cè)HGF基因?qū)PCs增殖的促進(jìn)作用；Transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力；3D培養(yǎng)法觀察細(xì)胞體外血管形成能力。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功分離和培養(yǎng)出大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，并通過細(xì)胞功能檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面抗原來鑒定。
　　 2.成功將HGF基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細(xì)

4、胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達(dá)；在HGF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到HGF的表達(dá)，第1天、2天、4天、7天、11天濃度分別為22.15±3.77 ng/ml、39.42±7.32ng/ml、99.09±9.89ng/ml、311.87±26.56 ng/ml、224.72±20.91 ng/ml，而空載腺病毒組、陰性對(duì)照組沒有檢測(cè)出HGF的表達(dá)；轉(zhuǎn)染后HGF基因?qū)υ囵B(yǎng)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的促增殖作用，轉(zhuǎn)染4天和7天，轉(zhuǎn)染

5、組血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖明顯加快，與空載腺病毒組和陰性對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)；3D培養(yǎng)可見血管樣結(jié)構(gòu)形成。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外條件下能夠從大鼠骨髓中成功分離出單個(gè)核細(xì)胞并誘導(dǎo)培養(yǎng)出血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 2.通過腺病毒介導(dǎo)，可成功的將HGF基因轉(zhuǎn)染入大鼠血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，并且在培養(yǎng)上清液中可檢測(cè)到HGF蛋白，證實(shí)轉(zhuǎn)染后的目的基因能夠在細(xì)胞中有效的表達(dá)并促進(jìn)EPCs增殖