HGF促進(jìn)hUCMSCs血管新生的體外研究.pdf

1、目的:缺血性疾病,如缺血性腦卒中、缺血性心肌病、股骨頭缺血性壞死、缺血性腸病等,是臨床上一類嚴(yán)重危害人民群眾健康的疾病。隨著近年來社會和經(jīng)濟的不斷發(fā)展人們膳食結(jié)構(gòu)的改變,高糖高脂飲食,生活工作壓力增加,社會人口老年化等原因,導(dǎo)致該類疾病的發(fā)病率逐年上升并且趨向年輕化,已成為困擾公眾的社會問題。由于該類疾病致病過程慢性進(jìn)行性、發(fā)病突然、致死致殘率高,不但嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量,使其飽受痛苦,還給其家庭、社會及國家?guī)砹顺林刎?fù)擔(dān)。
　

2、　目前臨床上通過采用藥物溶栓或抗凝、血管搭橋、介入手術(shù)等方式治療,在一定程度上可以改善患者的癥狀,但如果血管呈彌漫性病變或病變發(fā)生在直徑小于2mm的小血管,則無法取得滿意療效,而且手術(shù)存在再灌注損傷、危險性大、并發(fā)癥多、費用昂貴、術(shù)后再狹窄等缺點。因此,探索一個有效、簡便、可行的治療方法是當(dāng)前迫切需要解決的問題。
　　1993年,由Hockel等最早提出的應(yīng)用治療性血管新生療法,通過刺激局部血管的再生和損傷組織的再建達(dá)到治療目的,

3、是目前缺血性疾病治療、創(chuàng)傷修復(fù)等領(lǐng)域備受矚目的研究重點[1]。前期我們發(fā)現(xiàn)HGF有促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合,修復(fù)創(chuàng)傷部位[2];對犬下肢靜脈缺血模型的血管及肌肉等組織具有保護作用[3,4];同時可以上調(diào)Notch1及Dll4的mRNA水平[5]?；诖?本研究以hUCMSCs為體外研究細(xì)胞模型,以前期課題組合成的重組腺病毒Ad-HGF為研究對象,系統(tǒng)分析Ad-HGF通過Notch1/Dll4信號通路的調(diào)控作用對hUCMSCs增殖能力、細(xì)胞周期、

4、細(xì)胞毛細(xì)管腔狀結(jié)構(gòu)形成、遷移能力等功能的影響;Notch1/Dll4信號通路及血管動靜脈標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平的變化。最終闡明HGF與hUCMSCs信號通路的關(guān)系及機制,揭示Ad-HGF促進(jìn)動靜脈血管分化的作用,具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。
　　一、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及誘導(dǎo)分化。
　　方法:取正常足月生產(chǎn)新生兒臍帶,采取組織貼壁法分離原代hUCMSCs,觀察細(xì)胞生長形態(tài)。采取流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測hUCM

5、SCs細(xì)胞表型及細(xì)胞周期。通過成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)和成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)鑒定hUCMSCs的誘導(dǎo)分化能力。
　　結(jié)果:成功分離和培養(yǎng)hUCMSCs原代細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志CD44(96.73％)和CD105(96.10%),整合素受體CD29(99.53%);低表達(dá)造血系標(biāo)志CD34(0.8%)和CD45(1.91%),人白細(xì)胞抗原HLA-DR(1.41%),符合hUCMSCs細(xì)胞表型特征。細(xì)胞周期檢測大部分hUCMS

6、Cs處于G0/G1期。hUCMSCs成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo),出現(xiàn)神經(jīng)元樣細(xì)胞,Nestin蛋白免疫組化檢測陽性。hUCMSCs成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo),出現(xiàn)空泡樣脂滴,油紅O染色檢測陽性。
　　結(jié)論:成功分離及培養(yǎng)了具有多向分化潛能的hUCMSCs,可以用于后續(xù)實驗的研究。
　　二、人Notch1受體shRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定。
　　方法:根據(jù)GeneBank中Notch1基因mRNA序列(NM_017617)設(shè)計合成shRN

7、A序列,并且連接到pGenesil-1.1質(zhì)粒上,酶切及測序鑒定。通過體外同源重組將Notch1-shRNA表達(dá)框轉(zhuǎn)移至腺病毒表達(dá)載體pGsadeno上,酶切線性化后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293,制備獲得重組腺病毒。腺病毒轉(zhuǎn)染hUCMSCs,觀察細(xì)胞形態(tài)及GFP蛋白的表達(dá),提取總RNA和總蛋白,RT-PCR及Western Blot檢測細(xì)胞Notch1的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:經(jīng)酶切及DNA測序重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建正確。轉(zhuǎn)

8、染hUCMSCs后,RT-PCR及WesternBlot檢測,可顯著抑制細(xì)胞Notch1的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá),對基因轉(zhuǎn)錄沉默效率約為68.04%(P<0.05);對蛋白表達(dá)默效率約為80.32%(P<0.05)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了重組腺病毒rAd5-Notch1-shRNA,能高效轉(zhuǎn)染hUCMSCs細(xì)胞,具有Notch1基因沉默效應(yīng)。
　　三、Ad-HGF誘導(dǎo)hUCMSCs向血管動靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化的體外研究。
　　

9、方法:以hUCMSCs為研究對象,實驗分為五組:腺病毒Ad-GFP組、Ad-GFP-Notch1-shRNA組(簡稱為Ad-shRNA組)、Ad-GFP-NICD組(簡稱為Ad-NICD組)、Ad-HGF組和空白對照組。首先通過MTT實驗檢測各組細(xì)胞生存率,判定各組腺病毒的最佳感染MOI。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。ELISA實驗檢測Ad-HGF組細(xì)胞培養(yǎng)上清中HGF的表達(dá)水平。MTT法測定OD490nm值,繪制細(xì)胞生長曲線。流式細(xì)胞儀檢

10、測各組細(xì)胞周期情況。隨后分別檢測各組細(xì)胞貼壁能力、遷移能力及體外成血管能力。實時定量熒光PCR法檢測Notch信號通路中:Notch1、Dll4及Hey-2基因;靜脈標(biāo)志物EphB4基因;動脈標(biāo)志物ephrinB2基因的轉(zhuǎn)錄水平。最后WesternBolt檢測Notch1、EphB4及ephrinB2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:Ad-GFP組最佳MOI為100倍;Ad-NICD組、Ad-shRNA組及Ad-HGF組最佳MOI為50倍。

11、轉(zhuǎn)染后鏡下觀察,除Ad-HGF組外,其他各組,均出現(xiàn)GFP的表達(dá);Ad-NICD組,細(xì)胞增殖速度快,形成多個不完整的管腔樣結(jié)構(gòu);Ad-HGF組,細(xì)胞分散生長,早期增殖速度較快,隨后出現(xiàn)了大量的分泌小泡。ELISA檢測Ad-HGF組培養(yǎng)48h后,上清中HGF的表達(dá)與對照組相比顯著增多(P<0.05),96h達(dá)到峰值562.97±27.09pg/mL。Ad-NICD組和Ad-HGF組能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖,在48、72、96h時具有顯著差異(P

12、<0.05);Ad-shRNA組能抑制細(xì)胞增殖,在72h時具有顯著差異(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測,Ad-NICD組細(xì)胞S期比例有較大增高(36.02%),細(xì)胞DNA復(fù)制活躍,具有較強增殖活性。細(xì)胞貼壁實驗中,Ad-HGF組在12、16、20h及Ad-NICD組在20h細(xì)胞貼壁率大于對照組(P<0.05);Ad-shRNA組在8、12、16h細(xì)胞貼壁率小于對照組(P<0.05)。Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)Ad-HGF組及Ad-N

13、ICD組能促進(jìn)細(xì)胞遷移,而Ad-shRNA組抑制細(xì)胞遷移(P<0.05)。體外成血管實驗,Ad-NICD組和Ad-HGF組出現(xiàn)了明顯的管狀結(jié)構(gòu),其余各組未見。實時定量熒光PCR檢測,Ad-HGF組及Ad-NICD組的Notch1、Dll4、Hey-2基因轉(zhuǎn)錄水平高于其余各組(P<0.05),而Ad-shRNA組則低于其余各組(P<0.05),Ad-GFP組與空白對照組之間、Ad-HGF組與Ad-NICD組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)

14、。靜脈標(biāo)志物EphB4基因,Ad-GFP組、Ad-HGF組及Ad-shRNA組與空白對照組相比較,無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),而Ad-NICD組基因轉(zhuǎn)錄水平高于空白對照組(P<0.05)。動脈標(biāo)志物ephrinB2基因,Ad-GFP組、Ad-shRNA組和空白對照組之間、Ad-HGF組與Ad-NICD組之間,無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),Ad-HGF組和Ad-NICD組細(xì)胞的ephrinB2基因轉(zhuǎn)錄水平高于其余各組(P<0.05)。W