神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管形成作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、神經(jīng)生長(zhǎng)因子是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的研究領(lǐng)域中一直占有領(lǐng)先地位，其生物學(xué)作用非常廣泛，分神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)系統(tǒng)兩類，不僅對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、維持神經(jīng)元存活和神經(jīng)損傷后的修復(fù)有重要作用，而且除神經(jīng)系統(tǒng)外還有許多其他作用。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)NGF可單獨(dú)或與其他生物活性因子一起作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)新生血管的形成。雖然NGF促進(jìn)新生血管形成的作用在多個(gè)領(lǐng)域取得很大進(jìn)展，關(guān)于NGF在視網(wǎng)膜血管病變新生血管形成中的作用，國(guó)內(nèi)外目前沒有

2、任何研究報(bào)道。因此，本研究首次在離體細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物及人體實(shí)驗(yàn)中探討了NGF與視網(wǎng)膜新生血管形成的關(guān)系。 第一部分 NGF促進(jìn)入視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 觀察正常及缺氧條件下NGF對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制。 方法： 原代培養(yǎng)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，取第3代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別在正常和缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞，用氯化鈷模擬細(xì)胞化學(xué)缺氧。 1.

3、正常、缺氧培養(yǎng)條件下HRCEC生長(zhǎng)狀態(tài) 取第3代HRCEC接種于96孔板，分別進(jìn)行正常和缺氧培養(yǎng)，用MTT法檢測(cè)第1、2、3、4天的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。 2.MTT法檢測(cè)不同因子對(duì)正常和缺氧條件下培養(yǎng)的HRCEC的影響 取第3代HRCEC接種于96孔板，分別進(jìn)行正常和缺氧培養(yǎng)。按下表接種后24小時(shí)加入干預(yù)培養(yǎng)液，于干預(yù)后第3天進(jìn)行MTT檢測(cè)。 3.HRCEC體外小管形成實(shí)驗(yàn) 取第3代HRCEC接種于M

4、atrigel，1h后添加各種培養(yǎng)液，培養(yǎng)12h后于倒置相差顯微鏡下觀察攝像。用Image-Pro Plus軟件分析比較小管的面積。 結(jié)果： 1.正?；蛉毖跖囵B(yǎng)條件下HRCEC均呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，第1天2組HRCEC細(xì)胞數(shù)目無明顯差別，第2天缺氧組較正常組細(xì)胞數(shù)目有增加，第3、4天數(shù)目顯著增多。 2.不同因子對(duì)正常或缺氧條件下培養(yǎng)的HRCEC增殖的影響結(jié)果相同。1）隨NGF濃度增加HRCEC細(xì)胞數(shù)目有明顯增多趨勢(shì)

5、，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析NGF三組間差異有顯著性意義；2） NGF+K252a組較同濃度NGF組HRCEC細(xì)胞數(shù)目減少，隨K252a濃度增加HRCEC細(xì)胞數(shù)目減少趨勢(shì)愈加顯著，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析三組間差異有顯著性意義；3）bFGF組與陰性對(duì)照組比較細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞數(shù)目明顯多于NGF20ng/ml及NGF50ng/ml組，稍多于NGF100ng/ml組但統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異；4） bFGF+K252a組與bFGF組比較細(xì)胞數(shù)目無明顯區(qū)別。 3

6、.二維基質(zhì)膠中毛細(xì)血管形成實(shí)驗(yàn)表明：1）在正常培養(yǎng)液HRCEC形成不完全的、松散的管狀結(jié)構(gòu)；2）NGF、bFGF組HRCEC形成完整的管狀結(jié)構(gòu)，小管面積均明顯大于正常培養(yǎng)液組，NGF組小管面積小于bFGF組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異；3）NGF+K252a組小管結(jié)構(gòu)完整性被打破，小管面積小于NGF組；4）bFGF+ K252a組小管結(jié)構(gòu)、面積與bFGF50ng/ml組比較無明顯改變。 結(jié)論： 1.氯化鈷誘導(dǎo)的細(xì)胞缺氧模型可促

7、進(jìn)HRCEC的增殖。 2.NGF促進(jìn)HRCEC的增殖，該作用可被特異性TrkA阻斷劑K252a所阻斷。 3.NGF促HRCEC增殖作用及K252a抑制NGF的作用呈濃度依賴性。 4.NGF可在體外促進(jìn)視網(wǎng)膜新生毛細(xì)血管管腔的形成，該作用可被K252a所阻斷。 5.NGF促進(jìn)HRCEC增殖和血管管腔形成的作用弱于bFGF，K252a無法阻斷bFGF的作用。 第二部分 NGF在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠中表

8、達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 觀察氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管增殖模型小鼠視網(wǎng)膜NGF的含量變化，探討NGF在視網(wǎng)膜新生血管形成中的作用。 方法： 將鼠齡為7天的C57BL/6J幼鼠連同母鼠置于含氧體積分?jǐn)?shù)為75％的氧箱中連續(xù)飼養(yǎng)5天，在P12將其放回正常大氣環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)，使其處于相對(duì)缺氧狀態(tài)，建立氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜血管增殖模型。同時(shí)將同日齡小鼠置于正常空氣環(huán)境中生活作為正常對(duì)照組。分別于出生后12、17、24天處死

9、，取出雙眼視網(wǎng)膜，用熒光定量PCR方法檢測(cè)48只小鼠視網(wǎng)膜NGFmRNA基因的表達(dá)、ELISA檢測(cè)60只小鼠視網(wǎng)膜NGF水平、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)24只小鼠視網(wǎng)膜NGF的表達(dá)。 結(jié)果： 1.正常組小鼠視網(wǎng)膜血管隨時(shí)間發(fā)育良好。OIR組小鼠12d在中周部視網(wǎng)膜出現(xiàn)大片無灌注區(qū)，未見新生血管出現(xiàn)；17d小鼠視網(wǎng)膜新生血管大量出現(xiàn)，24d小鼠視網(wǎng)膜新生血管自行完全消退。 2.熒光定量PCR方法檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜NGFmRNA

10、基因的表達(dá) 1）17d實(shí)驗(yàn)組NGFmRNA表達(dá)水平最高，明顯高于17d正常組及其他各實(shí)驗(yàn)及正常組；2）12d實(shí)驗(yàn)組NGFmRNA表達(dá)水平低于17、24d實(shí)驗(yàn)組，低于12d正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差別；3）24d實(shí)驗(yàn)組NGFmRNA表達(dá)水平高于24d正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差別；4）正常組12、17、24d間比較NGFmRNA表達(dá)水平隨小鼠天數(shù)的增加而增高但組間比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差別。 3.ELISA檢測(cè)小鼠視網(wǎng)

11、膜NGF蛋白表達(dá)水平結(jié)果分析同熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果。 4.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜NGF的表達(dá) NGF陽性表達(dá)產(chǎn)物均呈棕褐色，定位于細(xì)胞漿，細(xì)胞核一般不著色。陽性表達(dá)產(chǎn)物主要見于內(nèi)叢狀層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及神經(jīng)纖維層，其中以神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層表達(dá)最為明顯。出生后第17天，OIR組表達(dá)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組，其他各組無明顯區(qū)別。 結(jié)論： 1.缺氧是視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生的主要原因。 2.視網(wǎng)膜新生血管形成

12、時(shí)內(nèi)源性的NGF表達(dá)上調(diào)，新生血管消退則NGF表達(dá)下降。 3.NGF水平變化與視網(wǎng)膜新生血管形成有著密切的關(guān)系，內(nèi)源性的NGF可能參與并促進(jìn)了局部缺血視網(wǎng)膜組織的新生血管形成過程。 第三部分 NGF促進(jìn)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠視網(wǎng)膜新生血管生成的實(shí)驗(yàn)研究 目的： 觀察NGF眼內(nèi)注射對(duì)氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管形成的作用。 方法： 建立OIR小鼠模型，選取P12出氧箱時(shí)常規(guī)雙眼前后節(jié)檢查均無異常者隨

13、機(jī)分為4組：NGF注藥組、bFGF注藥組、NGF+bFGF組、K252a注藥組，每組各15只。均以右眼為注藥眼，左眼作為自身對(duì)照眼。所有小鼠左眼除K252a組注射微量DMSO加生理鹽水外均玻璃體腔注射生理鹽水作陰性對(duì)照。P17處死小鼠，熒光素灌注視網(wǎng)膜鋪片檢測(cè)視網(wǎng)膜新生血管和無熒光素灌注區(qū)面積，視網(wǎng)膜石蠟切片HE染色計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。 結(jié)果： 1.視網(wǎng)膜鋪片檢測(cè)無灌注面積的變化 1） NGF

14、、bFGF及混合注藥組注藥眼視網(wǎng)膜鋪片無灌注區(qū)面積小于對(duì)照眼，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異；2）K252a組注藥眼視網(wǎng)膜鋪片無灌注面積與對(duì)照眼比較無明顯差別；3） NGF、bFGF及混合注藥組注藥眼間比較視網(wǎng)膜鋪片無灌注區(qū)面積無明顯差別，三組注藥眼視網(wǎng)膜無灌注面積均小于K252a組注藥眼，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異。 2.視網(wǎng)膜鋪片檢測(cè)新生血管面積的變化 1） NGF、bFGF及混合注藥組注藥眼視網(wǎng)膜鋪片新生血管面積大于對(duì)照眼，統(tǒng)

15、計(jì)學(xué)分析有顯著性差異；2）K252a組注藥眼視網(wǎng)膜鋪片新生血管面積小于對(duì)照眼，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異；3）NGF、bFGF及混合注藥組注藥眼間視網(wǎng)膜鋪片新生血管面積比較：NGF+bFGF注藥眼＞bFGF注藥眼＞NGF注藥眼，組間比較P值均＜0.05，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異。 3.視網(wǎng)膜切片檢測(cè)新生血管的定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析同視網(wǎng)膜鋪片檢測(cè)新生血管面積的變化。 結(jié)論： 1.NGF、bFGF可促進(jìn)OIR小鼠缺血視網(wǎng)膜組

16、織的新生血管形成，NGF促血管形成作用弱于bFGF。 2.NGF和bFGF具有協(xié)同刺激OIR小鼠缺血的視網(wǎng)膜組織新生血管形成的作用。 3.K252a可抑制OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管的形成，原因可能是其與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的TrkA特異性結(jié)合阻斷了視網(wǎng)膜內(nèi)源性NGF的生血管作用。 第四部分 NGF在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血中表達(dá)水平變化的研究 目的： 探討NGF是否參與和促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管

17、的形成。 方法： 研究對(duì)象分四組：正常健康組20例，糖尿病無視網(wǎng)膜病組50例，非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變組50例，增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變50例，收集臨床資料：年齡、糖尿病類型、糖尿病病程、收縮壓、舒張壓、糖化血紅蛋白、尿素氮、肌酐，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)外周血血漿NGF含量。 結(jié)果： PDR患者血漿中NGF水平高于CG組、NDR組、NPDR組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血漿NGF水平與糖尿病病程、HbA1