腺苷在視網(wǎng)膜新生血管形成中的作用-.pdf

1、背景:
　　視網(wǎng)膜新生血管性疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病變(proliferativediabeticretinopathy,PDR)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等造成的滲出、出血等病理改變可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害,甚至失明。對(duì)于此類疾病,目前應(yīng)用最廣的抗VEGF治療和其它方法均不足以持續(xù)高效抑制血管生成,而玻璃體切除手術(shù)也只是對(duì)其造成視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥的無奈之舉。視網(wǎng)膜新生血管的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,在此過程中,腺苷具有重要作用

2、。研究表明,腺苷或其擬似物可以通過上調(diào)VEGF、IGF-1、bFGF、IL-8、Ang-2等促血管生成因子,以及下調(diào)抑制血管生成因子,如TNF-a等,來誘導(dǎo)血管新生。這就提示,腺苷作為體內(nèi)廣泛存在的生理調(diào)質(zhì),對(duì)于視網(wǎng)膜血管生成可能具有重要啟動(dòng)作用,因此,開展從源頭上抑制視網(wǎng)膜新生血管產(chǎn)生的研究,具有重要意義。
　　目的:
　　本研究擬通過探討臨床視網(wǎng)膜新生血管性疾病患者玻璃體腔腺苷濃度與血管生成間的關(guān)系,結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確阻斷

3、腺苷作用對(duì)于視網(wǎng)膜血管新生的抑制效應(yīng),從而證實(shí)腺苷具有促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管形成的作用,為視網(wǎng)膜新生血管性疾病的發(fā)病機(jī)制和干預(yù)策略提供新的研究方向和治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.收集在本院眼科行玻璃體切除手術(shù)的患者共30例,根據(jù)患者有無視網(wǎng)膜新生血管,分為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR共16例16眼)組和對(duì)照組(孔源性視網(wǎng)膜脫離、黃斑前膜、特發(fā)性黃斑裂孔共14例14眼)。于患者玻璃體切除手術(shù)中收集玻璃體、視網(wǎng)膜增殖膜及黃斑前膜

4、。應(yīng)用HPLC檢測(cè)患者玻璃體腺苷的濃度和誘導(dǎo)腺苷生成的關(guān)鍵酶-CD73的活性,WesternBlot檢測(cè)膜樣本中CD73蛋白的表達(dá)。
　　2.選用C57BL/6J健康新生鼠建立OIR(Oxygen-inducedretinopathy,氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變)動(dòng)物模型,出生后第7天(P7)放入高氧環(huán)境中連續(xù)飼養(yǎng)5天,然后置入空氣中繼續(xù)飼養(yǎng)。正常對(duì)照組小鼠在空氣中飼養(yǎng)。模型組和正常對(duì)照組小鼠于P17天行DiI心臟灌注視網(wǎng)膜鋪片,熒光顯微鏡

5、下觀察視網(wǎng)膜新生血管形態(tài);視網(wǎng)膜組織切片H&E染色后計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜前膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目。于P13、P15、P17天提取兩組小鼠視網(wǎng)膜組織,高效液相色譜儀(HPLC)檢測(cè)視網(wǎng)膜腺苷濃度;WesternBlot檢測(cè)視網(wǎng)膜CD73的表達(dá)差異。隨機(jī)選取模型組小鼠在出氧倉后連續(xù)5天腹腔內(nèi)注射非選擇性腺苷受體拮抗劑XAC(Xanthineaminecongener,黃嘌呤胺同源物),陰性對(duì)照組小鼠腹腔內(nèi)注射同等劑量的0.1％DMSO(Dimet

6、hylSulfoxide,二甲基亞砜),觀察XAC對(duì)視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用。
　　結(jié)果:
　　1.HPLC檢測(cè)人眼玻璃體腺苷濃度在PDR組表達(dá)高于對(duì)照組[(63.50±11.60)μmol/Lvs(30.34±6.41)μmol/L],差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　2.PDR組患者的年齡、糖尿病病程、術(shù)前空腹血糖均與玻璃體腺苷濃度無相關(guān)關(guān)系(r=0.255,P=0.340;r=0.318,P=0.230

7、;r=0.341,P=0.197)。
　　3.WesternBlot檢測(cè)增殖膜CD73酶在PDR組表達(dá)高于對(duì)照組(0.84±0.08vs0.39±0.05),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。
　　4.HPLC檢測(cè)2組臨床膜樣本E-ADO的生成量,結(jié)果顯示反應(yīng)20min時(shí),PDR組生成E-ADO的量較對(duì)照組高(54.1±7.1vs21.9±2.9),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。
　　5.P17行心臟灌

8、注視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示:模型組小鼠視網(wǎng)膜自視乳頭向中周部大片無灌注區(qū),視網(wǎng)膜大血管走行迂曲,不規(guī)則擴(kuò)張,可見新生血管叢;正常對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜血管未見明顯異常。視網(wǎng)膜組織切片H&E染色結(jié)果顯示:模型組小鼠可見大量突破視網(wǎng)膜前膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核,與正常對(duì)照組P17小鼠相比其突破視網(wǎng)膜前膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)具有顯著性差異[(41.7±6.1)個(gè)/片vs(2.7±1.9)個(gè)/片;p=0.000]。
　　6.正常對(duì)照組小鼠在P13、P15、P1

9、7天每毫克視網(wǎng)膜腺苷含量分別為:(0.048±0.008)ng、(0.069±0.004)ng、(0.52±0.007)ng;OIR模型組小鼠在P13、P15、P17天每毫克視網(wǎng)膜腺苷含量分別為:(0.839±0.043)ng、(1.066±0.108)ng、(1.369±0.107)ng。在P13、P15、P17天,兩組視網(wǎng)膜組織腺苷水平相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　7.OIR模型組和正常對(duì)照組相比,CD73

10、蛋白在P13、P15、P17天時(shí)OIR模型組視網(wǎng)膜組織中均表達(dá)上調(diào)(P=0.003;P=0.001;P=0.000)。
　　8.P17行DiI心臟灌注視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示:XAC注射組小鼠視網(wǎng)膜較DMSO注射組視網(wǎng)膜無灌注區(qū)及新生血管叢數(shù)量減少。視網(wǎng)膜組織切片H&E染色結(jié)果顯示:XAC注射組突破視網(wǎng)膜前膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目較DMSO注射組減少,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(17.3±3.9)個(gè)/片vs(38.1±5.6)個(gè)/片;p=0.

11、000]。
　　結(jié)論:
　　1.視網(wǎng)膜新生血管性疾病患者玻璃體及增殖膜腺苷濃度和CD73表達(dá)均高于對(duì)照組,提示腺苷及誘導(dǎo)其生成的酶CD73可能參與了視網(wǎng)膜新生血管性疾病的病理過程。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)腺苷及CD73蛋白參與了鼠視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)病過程。腺苷穩(wěn)態(tài)失衡可能是視網(wǎng)膜新生血管生成的啟動(dòng)因素。
　　3.腺苷受體拮抗劑可抑制OIR模型視網(wǎng)膜新生血管的形成,提示腺苷受體有可能成為視網(wǎng)膜新生血管疾病的治療