鞘注神經(jīng)生長因子促進(jìn)大鼠脛骨骨折愈合的實驗研究.pdf

1、研究背景： 隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，神經(jīng)系統(tǒng)與非神經(jīng)組織的相互營養(yǎng)作用逐漸被人們所認(rèn)識。臨床上常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷合并四肢骨折的患者骨折愈合加快，大量骨痂形成，甚至發(fā)生神經(jīng)源性異位骨化(NeurogenicHeterotopicOssification，NHO)。神經(jīng)系統(tǒng)究竟通過何種媒介、何種方式實現(xiàn)對成骨機(jī)制的調(diào)控，目前尚不明確。神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactor，NGF)與神經(jīng)肽(neuropeptide)廣泛存在

2、于神經(jīng)系統(tǒng)與外周組織，具有促進(jìn)多種組織修復(fù)的生物活性，一直以來被視為神經(jīng)系統(tǒng)與骨組織間可能的紐帶而倍受關(guān)注。國內(nèi)外的研究結(jié)果顯示，內(nèi)源性或外源性神經(jīng)生長因子均可促進(jìn)脊髓背根神經(jīng)節(jié)(Dorsalrootganglia，DRG)的神經(jīng)肽分泌，進(jìn)而對不同類型組織的生物學(xué)活性產(chǎn)生影響，提示"NGF—脊髓背根神經(jīng)肽—外周組織”可能是中樞神經(jīng)調(diào)控外周組織生理過程的一條共同通路。然而這一調(diào)控途徑是否對成骨機(jī)制構(gòu)成影響，尚無研究先例。本實驗旨在通過鞘注

3、NGF模擬腦外傷患者腦脊液中的生長因子濃度改變，聯(lián)系DRG與骨折骨痂中神經(jīng)肽表達(dá)的動態(tài)變化，觀察其對骨折愈合過程的影響。 目的： 通過構(gòu)建鞘注NGF的大鼠脛骨骨折模型，觀察脊髓背根神經(jīng)節(jié)和骨痂中降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitoningene—relatedpeptide，CGRP)、P物質(zhì)(SubstanceP，SP)的表達(dá)變化及其對大鼠脛骨骨折愈合的影響，分析NGF與神經(jīng)肽在骨折愈合過程中所起的作用，探討中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)

4、控成骨機(jī)制的可能途徑。嘗試驗證“神經(jīng)生長因子—脊髓背根神經(jīng)肽—骨”的調(diào)控途徑假說，探索骨科疾病的中樞治療途徑。為骨組織工程、臨床骨創(chuàng)傷及骨營養(yǎng)代謝性疾病的研究提供實驗依據(jù)。 方法： 1.實驗動物分組SPF級成年SD雄性大鼠48只，隨機(jī)分為NGF組、對照組各24只。每組又分為7d、14d、21d、28d各4個觀察組，各組6只。 2.模型制備 所有參與實驗大鼠以2％戊巴比妥腹腔注射麻醉后，作背部3cm切口，咬

5、除T10部分椎板顯露硬脊膜，蛛網(wǎng)膜下腔置入PE10導(dǎo)管至L1椎體水平。另于右小腿前外側(cè)切口，造成脛骨中段橫行骨折并以克氏針復(fù)位內(nèi)固定。 3.NGF干預(yù)術(shù)后當(dāng)日起，經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔單次注入2.5SmNGF1μg/day，連續(xù)注射14d，對照組給予等量生理鹽水。 4.標(biāo)本采集和切片制備觀察到期后，分批處死等數(shù)動物，4％多聚甲醛心內(nèi)灌注后取材。切取與右側(cè)坐骨神經(jīng)相連DRG常規(guī)石蠟包埋、切片。取大鼠完整右脛骨，行骨痂X線評分、骨痂/

6、骨干直徑比(A/B)值測定后，再用20％EDTA充分脫鈣，石蠟包埋、切片。 5.組織學(xué)及免疫學(xué)檢測取大鼠DRG與脛骨骨痂切片行蘇木素—依紅(HE)染色觀察組織學(xué)改變，SABC法行CGRP、SP免疫組織化學(xué)染色觀察神經(jīng)肽表達(dá)情況。顯微鏡下觀察免疫組化切片并拍照，ImagePro4.5圖像分析系統(tǒng)測定陽性產(chǎn)物的平均光密度(OD)值。 6.統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)以SPSS13.0軟件采用析因方差分析與單向方差分析(ANOVA)進(jìn)行

7、統(tǒng)計處理，骨痂X線評分組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗，骨痂A/B值與免疫組化OD值組間比較采用t檢驗。比較兩組間在骨痂體積、組織細(xì)胞學(xué)、免疫組織化學(xué)染色方面的差異。并用雙變量相關(guān)分析評價骨痂評分、骨痂A/B值、免疫組化OD值之間的相關(guān)性。 結(jié)果： 1.骨痂評價 術(shù)后14d對照組以纖維骨痂為主，NGF組已實現(xiàn)部分骨性愈合。術(shù)后28dNGF組骨痂評分低于對照組，差異有顯著性(P<0.05)。術(shù)后21d、28dNGF組骨痂

8、/骨干直徑比值(A/B值)低于對照組，差異有顯著性(P<0.05)。 2.骨痂組織學(xué)觀察術(shù)后7d：對照組骨折部被纖維骨痂和肉芽組織充填，骨膜反應(yīng)明顯。NGF組骨膜反應(yīng)輕微，纖維骨痂排列有序，間充質(zhì)細(xì)胞分化為少量成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞，髓腔側(cè)可見較多破骨細(xì)胞。 術(shù)后14d：兩組切片中均可見軟骨、骨性和纖維骨痂混雜，有大量的新生成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。對照組骨膜略增厚，成骨方式以膜內(nèi)成骨為主，軟骨骨痂成熟度較低，骨性骨痂細(xì)小且排列

9、較紊亂。NGF組骨膜無明顯增厚，軟骨內(nèi)成骨極為活躍，軟骨痂中成熟軟骨細(xì)胞所占比例大。骨性骨痂數(shù)量較多，直徑寬，且按力線方向排列有序，部分形成編織骨。破骨細(xì)胞與新生髓腔結(jié)締組織數(shù)目眾多，骨痂改建活躍。 術(shù)后21d：NGF組與對照組纖維骨痂逐漸成熟為軟骨痂和骨性骨痂，成骨細(xì)胞進(jìn)一步增殖，軟骨細(xì)胞肥大、鈣化。 術(shù)后28d：對照組骨折線已被大量編織骨和少量軟骨痂充填，破骨細(xì)胞活躍。NGF組幾乎全為成熟板層骨，僅余少量編織骨，骨痂

10、塑形改建更為完全，新生骨髓腔多數(shù)已和中心髓腔相通。 各時期NGF組骨性骨痂比例，成骨和破骨細(xì)胞指數(shù)均高于同期對照組。 3.DRG免疫組織化學(xué)染色術(shù)后7d兩組大鼠DRG內(nèi)均可見散在分布的少量中一小神經(jīng)元表達(dá)CGRP、SP陽性顆粒。NGF組陽性表達(dá)的神經(jīng)元數(shù)量較對照組多，部分呈線狀連續(xù)排列。隨時間進(jìn)展，兩組：DRG中陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目和強(qiáng)度增高。兩組DRG內(nèi)CGRP表達(dá)OD峰值均出現(xiàn)于術(shù)后21d。SP表達(dá)峰值，對照組出現(xiàn)于術(shù)

11、后21d，NGF出現(xiàn)于術(shù)后14d，之后隨著骨痂成熟表達(dá)強(qiáng)度逐漸降低。術(shù)后28d對照組僅有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)陽性顆粒，NGF組仍有較多免疫陽性細(xì)胞。NGF組各時期陽性產(chǎn)物OD值大于同期對照組，差異有顯著性(P<0.05)。 4.骨痂免疫組織化學(xué)染色術(shù)后7d，兩組骨痂中的新生成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞胞漿中有豐富陽性顆粒表達(dá)，NGF組髓腔側(cè)破骨細(xì)胞有中度—強(qiáng)陽性表達(dá)。7～14d兩組骨痂中表達(dá)強(qiáng)度逐漸上升。14d時，對照組成骨細(xì)胞與成熟軟骨細(xì)胞有

12、輕—中度陽性表達(dá)，NGF組幼稚軟骨細(xì)胞與骨小梁邊緣分布的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞有強(qiáng)陽性表達(dá)。兩組陽性產(chǎn)物表達(dá)的OD值高峰均出現(xiàn)于術(shù)后14～21d，隨著軟骨痂成熟表達(dá)強(qiáng)度逐漸降低。至術(shù)后28d，對照組殘留少量成熟軟骨細(xì)胞表達(dá)陽性顆粒，NGF組可見較多免疫陽性細(xì)胞。各時期NGF組OD值與對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。 5.相關(guān)性分析雙變量直線相關(guān)分析結(jié)果顯示骨痂評分與骨痂SP表達(dá)OD值呈負(fù)相關(guān)，DRG神經(jīng)肽表達(dá)OD值與骨痂O

13、D值呈正相關(guān)，關(guān)聯(lián)均有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 蛛網(wǎng)膜下腔給予外源性NGF可以促進(jìn)DRG肽能神經(jīng)元和骨折骨痂表達(dá)CGRP、SP，與對照組相比表達(dá)的強(qiáng)度更高，持續(xù)時間更久。鞘注NGF能減輕骨膜反應(yīng)，促進(jìn)成骨、軟骨與破骨細(xì)胞增殖并表達(dá)CGRP、SP，增強(qiáng)軟骨內(nèi)成骨過程，骨痂成熟加快，塑形改建過程提前且更為完全，骨痂體積減少的同時成骨的有序性提高，骨折愈合加快。推測中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能通過"NGF—DRG神經(jīng)肽—骨”傳導(dǎo)通路調(diào)控成骨過