脊髓完全性損傷大鼠脛骨骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究及神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)失神經(jīng)骨折愈合的影響.pdf

1、背景：在臨床實(shí)踐中觀察到一個(gè)現(xiàn)象，截癱和顱腦損傷患者伴隨的四肢骨折往往可以見到大量骨痂過(guò)度生長(zhǎng)，甚至在肌肉中可以出現(xiàn)異位骨化，但是這種骨痂強(qiáng)度差，編織骨向板層骨轉(zhuǎn)化慢，因此認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)參與了骨折愈合過(guò)程，推測(cè)神經(jīng)系統(tǒng)最終與骨生成和骨轉(zhuǎn)化有關(guān)。采用脫鈣的免疫組織化學(xué)方法對(duì)骨組織進(jìn)行研究中發(fā)現(xiàn)，骨不連的斷端骨痂、異位成骨及失神經(jīng)狀態(tài)下的骨痂在組織結(jié)構(gòu)上有一個(gè)共同點(diǎn)，就是少有或者沒有神經(jīng)支配，那么能否通過(guò)研究神經(jīng)對(duì)骨再生支配與調(diào)控機(jī)理，最終找

2、到解決骨不連及異位骨化的治療方法。 神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是于1952年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)中樞和外周神經(jīng)元生長(zhǎng)、發(fā)育、分化以及維持正常存活的作用已得到公認(rèn)。NGF廣泛分布于全身器官，除營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)外，還參與一些其他的生理活動(dòng)，如刺激單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)皮膚潰瘍、角膜潰瘍和皮膚切口的愈合，刺激毛細(xì)血管生長(zhǎng)以增加局部血供等。近來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)在正常骨組織和骨折骨痂中有NGF及其受體的表達(dá)，同時(shí)局部給予

3、外源性NGF對(duì)骨折愈合具有促進(jìn)作用。這說(shuō)明NGF可能也是骨折愈合復(fù)雜因子網(wǎng)絡(luò)中的一員。在失神經(jīng)狀態(tài)下能否應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子改善骨折過(guò)程中骨痂鈣化骨力差從而為神經(jīng)生長(zhǎng)因子促骨折愈合找到理論依據(jù)還是一個(gè)新的課題。 目的：1、對(duì)T10脊髓完全性橫斷損傷狀態(tài)下大鼠脛骨骨折模型的后肢感覺運(yùn)動(dòng)情況，動(dòng)物的存活率，骨痂生成情況進(jìn)行探討研究，從而確立較為理想的失神經(jīng)狀態(tài)下的骨折愈合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。 2、比較失神經(jīng)狀態(tài)下與正常骨折愈合過(guò)程中骨

4、折斷端剛度與強(qiáng)度，骨形態(tài)計(jì)量學(xué)中動(dòng)力性參數(shù)與靜力性參數(shù)，及骨密度的變化規(guī)律驗(yàn)證失神經(jīng)狀態(tài)對(duì)骨折愈合有重要影響作用。 3、探討失神經(jīng)狀態(tài)下骨痂組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、骨鈣素的表達(dá)、成骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，找到失神經(jīng)狀態(tài)下骨折愈合受到影響的原因。 4、失神經(jīng)狀態(tài)是否對(duì)骨痂中Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)有影響，把失神經(jīng)狀態(tài)影響骨折愈合的研究深入到蛋白水平。 5、外源性給予神經(jīng)生長(zhǎng)因子，比較觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)失神經(jīng)狀態(tài)下骨折愈合是否有改善

5、作用。 方法：1、建立T10脊髓完全性損傷狀態(tài)下大鼠脛骨骨折模型：于脊髓T10節(jié)段橫斷并切除2mm脊髓，開放性折斷左后肢脛骨造成骨折行髓內(nèi)針內(nèi)固定、石膏外固定，構(gòu)建脊髓完全性損傷大鼠失神經(jīng)狀態(tài)下脛骨骨折模型。 2、研究重點(diǎn)在骨折愈合中的第4w，即編織骨向板層骨轉(zhuǎn)化時(shí)期，運(yùn)用大體形態(tài)觀察了解骨折斷端的愈合情況：骨折線清晰程度、骨痂的大小，再骨折比例及塑形情況；脛骨標(biāo)本的濕重比較；X線片上計(jì)算比較外骨痂的量；CT斷層掃描計(jì)算

6、比較骨折斷端的最大橫截面直徑以及骨痂中軟骨性骨痂灰度值面積，比較骨痂生長(zhǎng)的量及未骨化的程度。 3、骨痂骨密度對(duì)比性研究探討失神經(jīng)狀態(tài)下骨折愈合的差異；三點(diǎn)折彎試驗(yàn)測(cè)定骨折斷端的彎曲剛度與彎曲強(qiáng)度了解失神經(jīng)狀態(tài)下骨折斷端的生物力學(xué)變化情況；骨痂不脫鈣制成樹脂切片進(jìn)行靜力學(xué)參數(shù)與動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定，比較分析失神經(jīng)狀下骨礦化異常變化。 4、運(yùn)用HE染色法比較失神經(jīng)狀態(tài)下骨痂與正常骨痂組織形態(tài)學(xué)上的不同；采用免疫組織化學(xué)法比較分析骨

7、痂中骨鈣素表達(dá)程度的差異；TEM(透射電鏡)比較分析脫鈣骨痂中成骨細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)的變化，探討失神經(jīng)狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞器的影響。 5、運(yùn)用Westernblot蛋白印記法動(dòng)態(tài)觀察失神經(jīng)狀態(tài)下骨痂中Ⅰ、Ⅱ型膠原的蛋白表達(dá)。 6、神經(jīng)生長(zhǎng)因子干預(yù)性治療脊髓損傷完全性損傷大鼠脛骨骨折，觀察愈合情況。 結(jié)果：1、T10脊髓完全性橫斷損傷可誘導(dǎo)出大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)感覺喪失，又不會(huì)造成嚴(yán)重的尿潴留、全身衰竭等情況。脛骨因?yàn)闊o(wú)大血管走行

8、，減少了因依附于大血管的交感神經(jīng)對(duì)骨折斷端局部神經(jīng)調(diào)節(jié)有作用。 2、脊髓完全性損傷下的骨折斷端的骨痂明顯多于正常神經(jīng)支配骨折斷端，且生物力學(xué)強(qiáng)度差，外源性給予NGF后骨折愈合情況得到改善統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P＜0.05)。 3、生物力學(xué)證實(shí)了失神經(jīng)狀態(tài)下導(dǎo)致了骨折斷端的強(qiáng)度與剛度等其它力學(xué)指標(biāo)明顯下降；骨計(jì)量學(xué)的靜態(tài)參數(shù)與動(dòng)態(tài)參數(shù)結(jié)果均表明失神經(jīng)狀態(tài)下骨折愈合中的類骨質(zhì)向骨質(zhì)轉(zhuǎn)變出現(xiàn)障礙；失神經(jīng)狀態(tài)下骨折斷端的骨密度較

9、正常骨愈合斷端低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較有顯著性差異，說(shuō)明失神經(jīng)狀態(tài)下影響了成骨細(xì)胞的活性、鈣鹽的沉積。 4、組織形態(tài)學(xué)中發(fā)現(xiàn)失神經(jīng)狀態(tài)下成骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨陷窩數(shù)少，鈣鹽線淺細(xì)；骨鈣素免疫組化顯示三組對(duì)比失神經(jīng)狀態(tài)下骨痂中骨鈣素的陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)弱，與正常骨痂組與神經(jīng)生長(zhǎng)因子干預(yù)組均有顯著性差異；TEM中觀察到失神經(jīng)狀態(tài)下成骨細(xì)胞突起少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不發(fā)達(dá)，相對(duì)萎縮，且在細(xì)胞核周圍出現(xiàn)了大量的溶酶體；神經(jīng)生長(zhǎng)因子干預(yù)的細(xì)胞中可以見到比較發(fā)達(dá)的

10、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參予合成Ⅰ型膠原的高爾基體，說(shuō)明神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞器活性有刺激作用。 5、對(duì)1w、2w、4w、5w骨折斷端的骨痂運(yùn)用Westernblot蛋白印記法分析比較Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)情況結(jié)果顯示無(wú)論是正常神經(jīng)支配還是失神經(jīng)失配骨折斷端均呈現(xiàn)由低表達(dá)到高表達(dá)最后低表達(dá)的過(guò)程，這與骨折愈合的規(guī)律相一致。Ⅰ型膠原蛋白在骨痂初期就有表達(dá)，證實(shí)了軟骨細(xì)胞也分泌Ⅰ型膠原。與正常骨折斷端相比，失神經(jīng)狀態(tài)下的骨折愈合過(guò)程中第2w的Ⅱ型膠原

11、高表達(dá)及第4wⅠ型膠原的相比較的低表達(dá)，都說(shuō)明失神經(jīng)狀態(tài)下影響了Ⅰ、Ⅱ型膠原正常分泌，從而影響了骨痂的最終骨化。 6、神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)失神經(jīng)狀態(tài)下骨折愈合有促進(jìn)與改善作用。療效對(duì)比有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論：1、T10脊髓完全性橫斷損傷狀態(tài)下大鼠脛骨骨折模型是目前較為理想的研究失神經(jīng)狀態(tài)下骨折愈合模型。 2、失神經(jīng)狀態(tài)下導(dǎo)致骨折斷端骨密度降低、骨痂礦化程度差、最終導(dǎo)致生物力學(xué)特性減弱。 3、失神經(jīng)