新脂肪因子CTRP3促進新生血管形成及機制研究.pdf

1、背景：鑒于糖尿病的高發(fā)病率，及其與心衰、慢性難愈性創(chuàng)面等疾病之間的關系，越來越多研究開始關注糖尿病與這些病理狀態(tài)之間的內在聯(lián)系。脂肪源性激素及細胞因子（脂肪因子）對心肌功能發(fā)揮重要的調節(jié)作用，大量的證據(jù)表明，大部分細胞因子（包括TNF-α、瘦素、TGF-β和抵抗素等）對心臟代謝、心肌細胞肥大、基質結構及其組成以及心肌細胞死亡起負性調節(jié)作用。雖然脂肪因子可促進細胞攝取糖，促進脂肪酸氧化，抵抗缺血/再灌注損傷，但是脂聯(lián)素對慢性心肌重構及心衰

2、發(fā)展的作用目前還是飽受爭議。是否還存在其他的脂肪因子，對心肌缺血后心肌重構起到正性調節(jié)作用，改善心臟功能，目前尚未明確。是否某種脂肪因子可以促進傷口邊緣血管化，從而加速傷口愈合目前受到人們的關注。
　　近來，人們發(fā)現(xiàn)了一個高度保守的脂聯(lián)素同源異構物家族，即C1q腫瘤壞死因子相關蛋白（CTRPs）家族。CTRPs家族包括15個成員，CTRP1-CTRP15，其中CTRP8和CTRP10是人特異性的，每個成員都是由四個結構域組成的，包

3、括N端的信號肽、短的可變區(qū)、膠原樣結構域和C端的C1q樣球狀結構域。CTRPs和脂聯(lián)素均屬于C1q/TNF蛋白超家族，由于越來越多的C1Q結構域蛋白被發(fā)現(xiàn)，C1q/TNF蛋白超家族成員不斷增加。盡管CTRPs家族成員的結構與脂聯(lián)素十分相似，但卻可以發(fā)揮許多不同的作用。近來有報道CTRP3第一個體內功能的研究，即CTRP3是一種維持血糖穩(wěn)態(tài)的代謝調節(jié)因子。也有研究報道CTRP3可以在體外促進內皮細胞的增殖及遷移，但是CTRP3在動物體內，

4、在心梗邊緣區(qū)是否可以促進新生血管的形成，目前尚未見報道。而且，CTRP3作為一種最新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子家族成員中的重要成員，對心梗后心肌重構會起到促進作用還是抑制作用，迄今尚未進行過相關研究。
　　目標：1）探討CTRP3體外促進新生血管形成的作用及機制；2）探討CTRP3是否可以在體內促進心梗邊緣區(qū)新生血管的形成，及其心肌保護作用的機制；3）探討CTRP3是否可以促進傷口邊緣血管化，從而促進傷口愈合。
　　方法：?合成制備CT

5、RP3：PCR法合成CTRP3球形結構域基因序列，在原核蛋白表達載體pET45b中克隆其片段，DNA測序進行驗證。?體外實驗：①成鼠心肌細胞培養(yǎng)：分離野生型小鼠成鼠心肌細胞，血清饑餓，使用Akt阻斷劑LY294002阻斷心肌細胞中Akt信號通路，闡明CTRP3促進血管化作用的機制。②HUVECs從ATCC購買。③小管形成實驗：將HUVECs種植于膠上，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后換成心肌細胞預處理培養(yǎng)基，6小時后觀察小管形成情況，Image-

6、Pro5.0軟件進行分析，并利用VEGF阻斷劑CBO-P11進行阻斷研究。④檢測生成NO的含量：檢測CTRP3對HUVECs生成NO含量的影響。⑤Westernblot分析蛋白表達：SDS-PAGE膠分離蛋白，轉移至PVDF膜，用相應的抗體孵育，檢測關注蛋白的表達。?心梗模型：①縫扎小鼠心臟左主降冠狀動脈，構建心梗模型。術后恢復后，將小鼠隨機分為四組：即空白對照組，空白對照給CTRP3組，手術對照組，及手術給CTRP3組。2周后處死小鼠

7、，在心梗邊緣區(qū)進行Masson染色、免疫染色和Westernblot等方法進行分析。②檢測心臟功能：植入腹腔微量給藥泵后2周，主要通過心臟超聲和血流動力學檢測心臟功能。③Masson染色的方法分析心臟梗死面積和膠原含量，切片進行CD31免疫組化染色和αSMA免疫熒光染色，檢測血管標志物含量。④Westernblot分析關注蛋白的表達。?傷口愈合模型：①用打孔器在小鼠背部打直徑6mm的孔，每天在創(chuàng)面邊緣給CTRP3，劑量為2μg/kg/d

8、，以給生理鹽水組為對照，7天后處死小鼠。②觀察并測量創(chuàng)面愈合情況及血管形成情況。③對切片進行HE染色，觀察血管新生情況。④對切片進行CD31和αSMA免疫染色，檢測新生血管形成情況。?統(tǒng)計分析：用統(tǒng)計軟件Prism進行統(tǒng)計分析，計算每組的均數(shù)和標準誤，One-wayANOVA與LSD-t檢驗進行多組間相互比較的統(tǒng)計分析，認為P<0.05有統(tǒng)計學差異。
　　結果：?CTRP3不顯著促進體外培養(yǎng)的內皮細胞（HUVECs）形成新生血管。

9、體外全長CTRP3及CTRP3球狀結構域作用并未見顯著促進HUVECs形成管狀結構，也沒有促進NO的生成。而在體內CTRP3作用可顯著激活缺血心肌Akt信號分子，增加HIF1-α及VEGF的表達，但是體外CTRP3作用HUVECs并不增加Akt信號激活，也不增加HIF1-α及VEGF的表達。?CTRP3促血管化作用是通過心肌細胞介導的Akt依賴信號通路實現(xiàn)的。CTRP3預處理的心肌細胞培養(yǎng)基可顯著增加HUVECs細胞管狀結構的形成，提示

10、CTRP3是通過誘導心肌細胞旁分泌細胞因子促進血管化作用的。而且，CTRP3作用增加了培養(yǎng)心肌細胞中Akt的激活及HIF1-α和VEGF的表達，并且表現(xiàn)為時間和劑量依賴性。此外，我們用Akt抑制劑阻斷Akt信號通路時，CTRP3無法增加心肌細胞中HIF1-α和VEGF的表達，預處理的培養(yǎng)基再處理HUVECs時，小管形成也未見增加。而且，當用VEGF特異性阻斷劑阻斷HUVECs細胞VEGF信號通路時，再用CTRP3預處理的心肌細胞培養(yǎng)基作

11、用HUVECs細胞，不再促進管狀結構的形成。?外源性補充CTRP3可顯著提高心梗后存活率，改善左室功能。外源性給予CTRP3可顯著提高動物生存率（P<0.05），而且可將左室收縮功能提高57％，dP/dtmax提高30.4％，左室收縮末壓（LVEDP）降低17.6％，P<0.05。?CTRP3作用抑制心梗后左室病理性心肌重構。我們通過大體觀察、超聲檢測及Masson染色等觀察心梗14天后心肌重構的程度。給予外源性CTRP3可以減小心臟大

12、小和體積，減小左室舒張末期內徑（LVEDD）和左室收縮末期內徑（LVESD）。而且，外源性CTRP3作用可顯著降低心梗邊緣區(qū)間質纖維化（與MI+Veh相比降低41％），并顯著增加缺血區(qū)肌細胞與纖維細胞的比例。?CTRP3在心肌梗死邊界區(qū)通過激活Akt-HIF1α-VEGF通路促進血管化。我們通過CD31免疫組化染色評價CTRP3促血管化作用，發(fā)現(xiàn)CTRP3作用顯著增加心梗邊界區(qū)CD31陽性的毛細血管數(shù)量，并且增加α-SMA陽性的小動脈密

13、度。CTRP3對AMPK及eNOs的激活并無明顯作用，但是卻可以顯著激活Akt，增加HIF1α和VEGF表達。這些結果提示這一過程可能激活了Akt-HIF1α-VEGF信號通路。為驗證CTRP3心肌保護作用是否是通過Akt-VEGF信號通路，我們在心梗模型的小鼠腹部植入載有Akt抑制劑LY294002和VEGF抑制劑CBO-P11的緩釋泵，檢測心臟功能及血管密度。與MI+CTRP3組相比，給予小鼠Akt抑制劑后，CTRP3改善心臟射血分

14、數(shù)（LVEF）的能力明顯受到抑制，促血管化作用也幾乎消失。但是，雖然給予VEGF抑制劑和給予Akt抑制劑對CTRP3促血管化作用的抑制效果類似，但是給予VEGF抑制劑只是部分阻斷了CTRP3的心臟保護作用。?CTRP3顯著抑制心梗邊緣區(qū)心肌細胞凋亡。TUNEL染色和Caspase3活性檢測結果均表明CTRP3可顯著減少細胞凋亡壞死。由于目前尚沒有CTRP3-KO的小鼠，我們體外將3T3細胞誘導成脂肪前體細胞，用這種預處理的培養(yǎng)基與體外分

15、離的成鼠心肌細胞共培養(yǎng)，驗證缺血缺氧損傷時內源性的CTRP3是否可以起到心肌保護功能。提前48h給予誘導的3T3細胞CTRP3小干擾RNA及對照無關小干擾RNA，然后用預處理培養(yǎng)基與成鼠心肌細胞共培養(yǎng)，然后給予成鼠心肌細胞低氧處理（2％O2，12h），檢測培養(yǎng)基中LDH釋放量及成鼠心肌細胞Caspase3活性。與單獨缺氧組（SI）相比，3T3細胞預處理培養(yǎng)基可顯著減少成鼠心肌細胞凋亡壞死。而且，用小干擾RNA阻斷誘導3T3細胞CTRP3

16、表達后，3T3預處理培養(yǎng)基處理的成鼠心肌細胞釋放的LDH含量和Caspase3活性顯著提高。?CTRP3可顯著促進創(chuàng)面血管化，加速創(chuàng)面愈合。CTRP3作用后3天，即可發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面愈合速度較對照組顯著增快，7天時傷口面積比對照組減小30％。對真皮下血管網(wǎng)拍照，HE染色及αSMA免疫染色分析，發(fā)現(xiàn)CTRP3作用可顯著增加創(chuàng)面邊緣新生血管的形成。
　　結論：我們的研究有幾個重要的發(fā)現(xiàn)：本研究首次報道了CTRP3促進新生血管形成作用，是通過細

17、胞與細胞之間相互作用的旁分泌途徑實現(xiàn)的；?本研究首次發(fā)現(xiàn)了CTRP3作為一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子家族中的重要成員，可以顯著提高心梗邊緣區(qū)新生血管的形成，抑制心肌細胞凋亡，實現(xiàn)對缺血心肌的保護作用；?我們首次發(fā)現(xiàn)CTRP3在缺血心肌促進新生血管形成是通過激活了Akt-HIF1α-VEGF信號通路實現(xiàn)的，進一步闡明了CTRP3促進新生血管形成作用的機制，為進一步研究打下堅實基礎；?我們首先觀察到脂肪因子CTRP3可以顯著促進創(chuàng)面邊緣新生血管形成