新生大鼠缺氧缺血性腦損傷時血管內皮生長因子表達與新生血管形成關系的研究.pdf

1、目的：新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是新生兒時期的常見病，缺氧缺血是HIBD后造成腦神經(jīng)組織損傷的主要因素。圍生期窒息時，腦組織經(jīng)歷缺氧-缺血-再灌注損傷或持續(xù)低灌注的病理生理過程，從而影響腦的結構和功能，導致腦損傷，由此可見，缺氧缺血后腦組織血運供應的改善與神經(jīng)元功能的恢復密切相關。血管內皮細胞生長因子(VEGF)家族是一組近年來新發(fā)現(xiàn)的血管新生因子，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生

2、長因子(PIGF)六大成員，近年來的研究表明，VEGF具有如下重要作用：(Ⅰ)調節(jié)生理和病理的血管和淋巴管的再生；(2)對外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用，并直接作用于神經(jīng)元、神經(jīng)髓鞘細胞，星形細胞、神經(jīng)干細胞和膠質細胞；(3)調節(jié)神經(jīng)再生；許多研究證明VEGF家族在成人腦血管疾病中發(fā)揮著重要作用，但有關VEGF在正常新生兒及缺氧缺血性腦損傷(HIBD)時腦組織中的分布和表達及腦組織新血管形成的研究甚少。本研究通過新生大鼠HI

3、BD動物模型，動態(tài)觀察正常生后7日齡新生大鼠及HIBD后不同時間腦VEGF蛋白的表達和分布以及HIBD后血管新生情況，并探討HIBD時腦皮質VEGF蛋白表達與血管新生之間的相互關系。 材料與方法：1.動物實驗部分正常生后7日齡新生Wistar大鼠176只，性別不限，體重9-18克，由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供，隨機分成實驗組和對照組，實驗組88只分為HI后0、4、8、12、24、48、72小時和7、14、21、28天組，每組8

4、只；對照組88只，按上述時間點分組，每組8只。參照文獻[1]制作HIBD模型。 (Ⅰ)HIBD組：分離并結扎右側頸內動脈，后將大鼠置于氧濃度為5％、氮氣濃度為95％的密閉容器中(500mm3進入氣體的流速5L/min)，持續(xù)時間20分鐘。 (2)對照組：僅分離右側頸內動脈不予結扎和缺氧。(3)標本采集：在缺氧缺血(HI)后不同時間點(0、4、8、12、24、48、72小時和7、14、21、28天)同時處死實驗組和對照組大

5、鼠，取腦固定，脫水，透明后浸蠟。 2.實驗方法(Ⅰ)石蠟切片HE染色。(2)應用免疫組織化學染色檢測VEGF蛋白在正常生后7日齡新生大鼠及HIBD后不同時間點的腦組織中的分布及表達情況：標本為腦組織石蠟切片，抗原行微波加熱修復，進行SABC染色，DAB顯色，蘇木素復染。(3)FⅧ-Rag的免疫組織化學檢測新生血管。 3.結果判定(Ⅰ)VEGF蛋白表達：400倍光鏡下觀察實驗結果，陽性表達的細胞漿呈棕黃色，胞核為藍色淡染。

6、 (2)新生血管表達：陽性產(chǎn)物定位于血管內皮細胞胞漿，胞核為藍色淡染。 4.統(tǒng)計學分析(1)400倍光鏡下每組每個時間點各隨機抽取8張切片，每張切片取5個高倍視野(腦皮質區(qū))，經(jīng)日本產(chǎn)的OLYMPUSBX51TF數(shù)碼相機采樣，用圖象分析系統(tǒng)選取陽性細胞著色率達90％以上時紅黃藍達到的色差百分比作為標準，經(jīng)metamorph軟件測定其光強度(OD值)作為VEGF蛋白的相對含量，將所得的OD值占總面積百分比作為標準進行比較；

7、(2)新生血管計數(shù)方法參照文獻[2]；(3)所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差值((x)±s)表示，統(tǒng)計學分析采用t檢驗，等級相關分析方法，P＜0.05有意義。 結果一、腦組織病理學觀察：顯微鏡下觀察：對照組大腦未見腦損傷形態(tài)學上的改變；模型組HI后0小時即可見灶狀出血，12小時神經(jīng)細胞及間質水腫明顯，12h-24h時腦皮質微血管可見明顯擴張，72小時有軟化灶及膠質增生小結出現(xiàn)，7天仍可見壞死病變。 二、新生大鼠腦組織內VEGF蛋

8、白表達動態(tài)變化：1.正常新生大鼠腦皮質VEGF蛋白的表達：正常新生大鼠生后第7天于腦組織多種細胞的胞漿中即可見VEGF表達，并集中于皮層和海馬，亦可見于髓質、軟腦膜、脈絡叢和血管內皮細胞，于第8天表達水平增多，第9天達高峰，以后逐漸降低，持續(xù)至生后第35天。 2.HIBD后新生大鼠腦皮質VEGF蛋白的表達：VEGF在HIBD大鼠腦組織中的表達定位與正常大鼠基本相同，于HI后0小時即可見表達，于HI后4小時表達逐漸增加，于48小時

9、達高峰后逐漸下降，可持續(xù)至HI后28天，并且于HI后4小時-14天時間點VEGF表達顯著高于對照組并具有統(tǒng)計學意義。 三、HIBD后腦皮質血管新生的動態(tài)觀察：皮層區(qū)可見各時間點正常新生大鼠腦組織新生毛細血管數(shù)變化不大，平均約3-8條/HP；而HIBD模型組于HI后3天-28天的新生血管數(shù)顯著多于對照組(P＜0.01)，血管新生高峰期為HI后3-7天，以后一直持續(xù)較高水平。 四、于HI后0-72小時VEGF表達程度與新血管