低氧誘導(dǎo)因子在大鼠角膜新生血管形成中的表達.pdf

1、背景：角膜新生血管(cornealneovascularization，CNV)破壞角膜的透明性，影響視力，嚴(yán)重時甚至致盲。多種病理因素可以導(dǎo)致CNV的形成，但是CNV的形成機制目前還尚未明確。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對CNV的發(fā)病機制認識也日趨深入，低氧誘導(dǎo)因子在CNV發(fā)病機制中的作用也得到重視。研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子(HIF)是各種低氧誘導(dǎo)基因調(diào)節(jié)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可以上調(diào)多種靶基因的表達，但迄今為止，HIF參與新生血管形成的機制仍不

2、清楚，角膜中是否表達HIF及何種類型細胞表達HIF也不清楚。
　　 目的：研究正常和縫線后大鼠角膜低氧誘導(dǎo)因子1α和2α（HIF1α、HIF2α），隨新生血管形成的表達變化和表達的細胞類型及與炎癥細胞的關(guān)系，探討HIF在角膜新生血管形成中可能的作用，為揭示角膜新生血管形成的機制提供依據(jù)。
　　 方法：以縫線誘導(dǎo)方法建立大鼠角膜新生血管模型，將SD大鼠隨機分為正常對照組和4個縫線實驗組，每組15只。對照組不做任何處理，實驗

3、組進行角膜縫線誘導(dǎo)新生血管形成。在縫線后第1、3、5、7天，觀察大鼠CNV的生長情況并記錄CNV的生長面積，并取角膜組織分別進行提取RNA、蛋白和固定及包埋切片，以實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-timeRT-PCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(WesternBlot)、原位雜交(insituhybridization)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)等實驗方法，檢測HIF1α和HIF2α在大鼠角膜縫線后各

4、時間點的表達和細胞的定位。并通過RT-PCR方法克隆大鼠HIF1α和HIF2α的cDNA，構(gòu)建大鼠HIF1α和HIF2α的表達載體，以檢驗?zāi)鼙籋IF1α和HIF2α抗體檢測的大鼠角膜組織蛋白是否屬于HIF1α和HIF2α蛋白。
　　 結(jié)果：對照組的角膜透明無血管，實驗組在角膜縫線后第1、3、5、7天，新生血管逐漸增多增長，面積逐漸增大。正常大鼠角膜的蛋白和mRNA中均能檢測到HIF1α和HIF2α的表達，HIF1α和HIF2α的

5、mRNA均表達于角膜組織的各層細胞。大鼠角膜縫線后，HIF1α的蛋白表達隨角膜新生血管的增多而減少，但對VEGFa蛋白的表達沒有影響，HIF1αmRNA的表達隨角膜新生血管的增多先增加后減少，不僅表達在角膜組織的各層細胞，也表達在新生血管的內(nèi)皮細胞，但不表達在浸潤的炎癥細胞;HIF2α的mRNA也表達在角膜組織的各層細胞和新生血管的內(nèi)皮細胞，也隨角膜新生血管的增多先增加后減少，但其蛋白的表達則沒有變化。大鼠HIF1α存在兩個亞型(iso

6、form)，它們的蛋白分子量分別為84和91kDa;HIF2α蛋白的分子量則為96kDa。
　　 結(jié)論：正常大鼠角膜均有HIF1α和HIF2α蛋白和mRNA的表達。正常角膜可能是處于低氧狀態(tài)。大鼠角膜HIF1α蛋白的表達不是隨著角膜新生血管的增多而增多，暗示HIF1α不是通過其表達的上調(diào)直接促進促血管生成因子的轉(zhuǎn)錄而參與新生血管的形成，其功能需要進一步的研究。HIF2α蛋白的表達不隨角膜新生血管的形成而改變，表明HIF2α可能不