CTRP9對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)是我國及世界范圍內(nèi)致死、致殘的首要原因，且其發(fā)病率、死亡率仍處于增長趨勢。ASCVD的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)，迄今為止，其病理生理機(jī)制仍未被完全揭示。眾多證據(jù)表明AS是脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥性血管疾病。斑塊內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)這兩個(gè)病理因素互相影響，促進(jìn)AS進(jìn)展。其中，巨噬細(xì)胞在AS中扮演著重要的角色。荷脂的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量的炎性細(xì)胞因子，參與AS發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段。因此，抑制斑塊內(nèi)巨

2、噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)對(duì)延緩AS的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。
　　C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9(CTRP9)是近年發(fā)現(xiàn)的新型脂肪細(xì)胞因子，隸屬于C1q腫瘤壞死因子超家族（C1q/TNF-related proteins，CTRPs）。目前研究顯示，CTRP9在調(diào)節(jié)代謝、保護(hù)心肌、改善內(nèi)皮功能及抵抗糖尿病心血管損害等方面發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究顯示，CTRP9可增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性并抑制斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。然而，CTRP9抑制

3、巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚不明確。因此，本研究將對(duì)CTRP9對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)和機(jī)制進(jìn)行深入探討。
　　研究目的:
　　(1)研究CTRP9對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響;
　　(2)探討CTRP9在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制。
　　材料和方法:
　　1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理
　　(1)以小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象。將細(xì)胞以DMEM+10％胎牛血清+1％雙抗配制成的完全培養(yǎng)基于37℃、50％

4、CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　(2)實(shí)驗(yàn)采用濃度為100ug/ml的氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激巨噬細(xì)胞建立炎癥模型。實(shí)驗(yàn)以CTRP9球狀結(jié)構(gòu)域重組蛋白(gCTRP9)預(yù)處理細(xì)胞，在完全培養(yǎng)基或oxLDL刺激下，檢測相關(guān)因子的表達(dá)差異。
　　2 Real-time PCR
　　提取各組細(xì)胞mRNA。檢測炎癥因子TNF-α、MCP-1的mRNA水平。
　　3 Western blot
　　提取各組

5、細(xì)胞總蛋白和/或核蛋白。檢測TNF-α、MCP-1、NF-κB、AMPK、AdipoR1的表達(dá)。
　　4 細(xì)胞免疫熒光
　　制作各組細(xì)胞爬片。激光共聚焦顯微鏡下觀察TNF-α、MCP-1及AdipoR1的表達(dá)以及NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況。
　　5 AdipoR1 siRNA轉(zhuǎn)染
　　篩選出抑制效果最優(yōu)的AdipoR1 siRNA序列。以Lipo2000轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

6、　　以SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行多組間統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1 CTRP9可抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)
　　Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，oxLDL可增加炎癥因子TNF-α和MCP-1的表達(dá)(p＜0.05);與oxLDL組相比，gCTRP9可濃度依賴性地降低TNF-α和MCP-1的表達(dá)(p

7、＜0.05)。同時(shí)，RT-PCR和激光共聚焦成像結(jié)果顯示，gCTRP9可顯著抑制oxLDL誘導(dǎo)的TNF-α和MCP-1的mRNA和蛋白的表達(dá)(p＜0.05)。
　　2 CTRP9可抑制巨噬細(xì)胞NF-κB的活化
　　Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，oxLDL可提高NF-κB的磷酸化水平(p＜0.05);與oxLDL組相比，gCTRP9可顯著降低NF-κB的磷酸化水平(p＜0.05)。Western blot及激

8、光共聚焦成像顯示，跟對(duì)照組相比，oxLDL可促進(jìn)NF-κB的核轉(zhuǎn)位(p＜0.05)，而gCTRP9可抑制oLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞核NF-κB的表達(dá)(p＜0.05)。
　　3 CTRP9在巨噬細(xì)胞中的抗炎作用依賴于AMPK磷酸化
　　Western blot結(jié)果顯示，gCTRP9可明顯提高AMPK的磷酸化水平(p＜0.05);而AMPK的抑制劑Compound C(Com C)顯著抑制gCTRP9引起的AMPK的磷酸化(p＜0.05

9、)。Western blot結(jié)果顯示，與gCTRP9+oxLDL組比較，Corn C取消了gCTRP9對(duì)炎癥因子TNF-α和MCP-1的抑制效果(p＜0.05);與gCTRP9+oxLDL組比較，Corn C取消了gCTRP9對(duì)NF-κB的抑制效果(p＜0.05)。
　　4 AdipoR1介導(dǎo)了CTRP9在巨噬細(xì)胞中的抗炎作用
　　Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，oxLDL不影響AdipoR1的表達(dá);與oxL

10、DL組比較，gCTRP9可增加AdipoR1的表達(dá)(p＜0.05);同時(shí)，激光共聚焦成像結(jié)果顯示，與oxLDL組比較，gCTRP9可顯著增加細(xì)胞膜表面AdipoR1的表達(dá)(p＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AdipoR1 siRNA可抑制gCTRP9引起的AMPK磷酸化(p＜0.05);與對(duì)照組比較，AdipoR1 siRNA取消了gCTRP9對(duì)炎癥因子TNF-α和MCP-1的抑制效果(p＜0.05)。