左旋咪唑?qū)AE大鼠脊髓炎癥相關(guān)細胞因子表達的影響.pdf

1、背景:20世紀80年代以來,國內(nèi)外陸續(xù)報道了600多例的"左旋咪唑引起腦炎綜合征(急性脫髓鞘白質(zhì)腦病)".多個項目的藥物流行病學(xué)研究證實左旋咪唑(levami sole,LMS)與原因未明脫髓鞘性白質(zhì)腦病存在因果關(guān)系.實驗研究也證實LMS對中樞炎性脫髓鞘腦病的動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)有明顯的促發(fā)加重作用. 目的：觀察LMS不同

2、階段給藥對Wistar大鼠EAE發(fā)病的影響及對其脊髓炎癥相關(guān)細胞因子表達的影響,探討LMS促發(fā)加重EAE的可能機制. 方法：Wistar大鼠四肢足墊皮下注射豚鼠脊髓勻漿(guinea pig spinal cordhomogenate,GPSCH)和完全弗氏佐劑(complete Freud'S adjuvant,CFA)制成的乳劑,免疫誘導(dǎo)EAE模型.將雌性Wistar大鼠45只,隨機分成五組:CFA對照組(8只)、EAE模型

3、組(8只)、LMS免疫前給藥組(LMS 1組,10只)、LMS免疫同時給藥組(LMS 2組,9只)、LMS免疫后間斷給藥組(LMS 3組,10只).LMS 1組、LMS 2組、LMS 3組的大鼠分別在GPSCH-CFA免疫前、免疫同時、免疫后腹腔注LMS 10mg·kg<'-1>.GPSCH-CFA免疫當日定為第0天,每同兩次觀察并記錄動物行為學(xué)及體重的變化.采用量化評分法,比較LMS不同階段給藥對EAE發(fā)病率、潛伏期、癥狀評分及病理組

4、織學(xué)評分的影響;免疫組織化學(xué)法測中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)星形膠質(zhì)細胞的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidiC protein,GFAP)表達,并進行定量分析;同時用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)法測大鼠脊髓干擾素-γ(interferon-Y,IFN-Y)、白介素-12

5、/23 P40(inter]eukin-12/23 P40,IL-12/23 P40)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)mRNA的表達,并將各細胞因子mRNA的表達水平與臨床癥狀評分作相關(guān)性分析. 結(jié)果：(1)行為學(xué)觀察:大鼠于免疫后11天開始陸續(xù)發(fā)病,EAE組發(fā)病率3/8(37.5﹪),潛伏期13.67±1.1

6、5天;LMSl組發(fā)病率5/10(50.0﹪),潛伏期14.40±2.07天,與EAE組比較無統(tǒng)計學(xué)差異;LMS2組發(fā)病率8/9(88.9﹪),潛伏期14.00±1.19天,發(fā)病率較EAE組高(P<0.05).病情嚴重程度相比,LMSl組和LMS2組較EAE組重:LMSl組的最大癥狀評分平均值(3.80±0.45)較EAE組(2.00±1.00)高(P<0.01),LMS2組的最大癥狀評分平均值(2.50±0.76)較EAE組略高,但統(tǒng)計

7、學(xué)上差異無顯著性;免疫后14天癥狀評分平均值比較,LMSl組(2.50±0.71)和LMS2組(2.00±0.00)均較EAE組(1.00±0.00)高(P<0.01,P<0.05).LMS1組和LMS2組的達最大癥狀時間(2.40±0.54天,2.00±0.53天)較EAE組(3.67±0.57天)短,提示LMS1組和LMS2組病情進展快.LMS3組首次發(fā)病率為2/10(20.0﹪),發(fā)病潛伏期、達峰時間、最大癥狀評分與EAE組比均無

8、顯著性差異;發(fā)病的2只大鼠癥狀持續(xù)5-6天即完全緩解,并分別在免疫后第23、25天相繼再次出現(xiàn)后肢無力、癱瘓等EAE癥狀,但是持續(xù)時間較短,2-3天即恢復(fù).(2)病理學(xué)變化:HE染色見發(fā)病大鼠CNS有大量炎性細胞浸潤,以淋巴細胞為主,分布以腦干和腰髓居多,主要表現(xiàn)為血管套形成,噬神經(jīng)現(xiàn)象、膠質(zhì)細胞結(jié)節(jié)等.LMS1組和LMS2組炎癥浸潤較EAE組重(P<0.05),LMS3組的炎癥浸潤程度與EAE組差不多.Kluver&Barrera髓鞘

9、染色見發(fā)病大鼠CNS內(nèi)有大小不等的片狀髓鞘脫失,大多局限在炎癥改變明顯的血管套周圍的白質(zhì)區(qū).CFA對照組大鼠CNS未見異常病理表現(xiàn).(3)星形膠質(zhì)細胞GFAP的免疫組化結(jié)果:CFA對照組CNS僅有少量細小突起著色的星形膠質(zhì)細胞:而EAE組CNS的GFAP陽性細胞數(shù)目比CFA對照組明顯增加(P<0.01).與EAE組比,LMS1組及LMS2組CNS的GFAP陽性細胞染色數(shù)目和染色強度均進一步增加(P<0.01);LMS3組與EAE組比無明

10、顯差異.(4)RT-PCR結(jié)果:與EAE組比,LMS1組脊髓IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA表達升高,TGF-β1和IL-10 mRNA表達下降,但僅IL-10有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);LMS2組脊髓IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA表達升高(P<0.05,P<0.01),TGF-β1和IL-10 mRNA表達下降(P<0.05,P<0.01);LMS3組除IL-12/23 P40 mRNA有顯著升高(P<

11、0.01)外,其他無顯著差異;CFA對照組脊髓細胞因子表達水平都很低(P<0.01).相關(guān)性分析結(jié)果顯示,脊髓IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA表達水平與臨床癥狀評分呈正相關(guān),脊髓TGF-β1和IL-10 mRNA表達水平與臨床癥狀評分呈負相關(guān). 結(jié)論：(1)左旋咪唑免疫前給藥能加重Wistar大鼠EAE的臨床癥狀,加速病情進展,并能加重其中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失;(2)左旋咪唑免疫同時給藥能使Wistar

12、大鼠EAE發(fā)病率增加,臨床癥狀加重,病情進展加速,并能加重其中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失:(3)左旋咪唑免疫后間斷給藥能促使Wistar大鼠EAE復(fù)發(fā):(4)EAE病情的輕重與Th1類細胞因子的表達呈正相關(guān),與Th2/Th3類細胞因子的表達呈負相關(guān);(5)左旋咪唑能促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)Th1類細胞因子IFN-γ和IL-12/23 P40 mRNA的表達,抑制Th2/Th3類細胞因子TGF-β1和IL-10 mRNA的表達,導(dǎo)致Th1/