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文檔簡介
1、目的:Rho/Rho 激酶(Rock)信號途徑是機(jī)體中普遍存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、粘附、移行等,被認(rèn)為是控制細(xì)胞行為的上游信號分子。近來研究發(fā)現(xiàn)許多神經(jīng)病理狀態(tài)均有Rock的激活,而應(yīng)用Rock 抑制劑可改善臨床癥狀和病理狀況。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Rho 激酶抑制劑Fasudil 治療C57BL/6小鼠EAE,觀察其臨床療效和潛在的免疫學(xué)機(jī)制,目的在于探討EAE的發(fā)病機(jī)制和應(yīng)用Fasudil 治療EAE的作用機(jī)制,為EAE和MS的
2、免疫病理機(jī)制提供新的理論支持,也為今后臨床應(yīng)用Fasudil 輔助治療MS等CNS 自身免疫性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為EAE組20只,F(xiàn)asudil 干預(yù)組20只,佐劑組20只。
EAE和Fasudil 干預(yù)組用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(MOG35-55)進(jìn)行免疫,建立EAE模型,佐劑組以等量生理鹽水代替MOG35-55作為EAE組的對照。Fasudil 干預(yù)組于免疫后
3、第7天腹腔注射Fasudil(50mg/kg/d),連續(xù)治療14天。EAE組和佐劑組給以等量生理鹽水作為對照。免疫后隔天觀察各組動物體重變化和發(fā)病情況,并按國際通用標(biāo)準(zhǔn)評定臨床癥狀。在免疫后4周處死動物,取小鼠脊髓腰膨大處,行HE 染色、Luxol Fast Blue 染色及間接免疫熒光染色,觀察各組小鼠病理變化及Rock-Ⅱ的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。
結(jié)果:
1.利用MOG35-
4、55 多肽成功地誘導(dǎo)了C57BL/6小鼠EAE 模型。EAE組發(fā)病率100%(n=20),平均起病時(shí)間為13.35±1.31天,高峰期平均癥狀評分3.80±0.78,高峰期平均體重15.75±0.81。在發(fā)病后第12天開始相繼出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,發(fā)病輕重不一,首先表現(xiàn)為進(jìn)食減少,活動量減少,皮毛不光滑,體重減輕,尾部無力下垂,隨病情加重出現(xiàn)一側(cè)后肢癱瘓,進(jìn)一步發(fā)展為雙側(cè)后肢癱瘓,不能自主翻身,嚴(yán)重者伴有前肢癱瘓,最高評分達(dá)到4分。Fas
5、udil 干預(yù)組發(fā)病率35%(n=20),較EAE組降低;平均起病時(shí)間15.55±1.50天,較EAE組明顯延遲(P<0.01);高峰期平均癥狀評分2.24±0.26,較EAE組降低(P<0.05);高峰期平均體重19.56±0.66,與EAE組相比差異顯著(P<0.05)。這4 項(xiàng)臨床指標(biāo)比較,F(xiàn)asudil 干預(yù)組與EAE組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。佐劑組未見發(fā)病,體重持續(xù)增加。
2.HE 染色結(jié)果顯示,EAE組小鼠出現(xiàn)明顯炎性
6、細(xì)胞浸潤, Fasudil 干預(yù)組和佐劑組則炎性浸潤較輕,EAE組、Fasudil 干預(yù)組和佐劑組Okuda 炎性細(xì)胞浸潤評分呈明顯差異。EAE組炎性細(xì)胞浸潤評分3.25±0.56,F(xiàn)asudil 干預(yù)組2.13±0.44,佐劑組1.38±0.78。EAE組和Fasudil 干預(yù)組、EAE組和佐劑組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Luxol Fast Blue 染色顯示,EAE組髓鞘脫失較Fasudil 干預(yù)組和佐劑組更明顯,且與病
7、情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。
3.Rock-Ⅱ在EAE組、Fasudil 干預(yù)組和佐劑組脊髓中均有表達(dá),且表達(dá)情況與小鼠的病情輕重程度和臨床評分相一致,在EAE組血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯表達(dá)。觀察同一視野脊髓內(nèi)Rock-Ⅱ陽性細(xì)胞的數(shù)量,EAE組小鼠為31.78±1.04,F(xiàn)asudil 干預(yù)組20.22±1.56,佐劑組為18.50±1.39,EAE組和Fasudil 干預(yù)組、EAE組和佐劑組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
8、> 結(jié)果表明Fasudil 干預(yù)組Rock-Ⅱ的表達(dá)明顯低于EAE組。
結(jié)論:
1.用MOG35-55抗原乳劑免疫C57BL/6小鼠,可成功建立EAE 模型。
2.Rho/Rock信號通路的激活與EAE 發(fā)病有關(guān)。
3.Rock 抑制劑——Fasudil能夠降低EAE的發(fā)病率,緩解EAE 臨床癥狀,減輕炎性細(xì)胞的浸潤和髓鞘脫失。
4.Rock 抑制劑――Fasu
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