小膠質(zhì)細胞Rho-ROCK通路調(diào)控對脊髓損傷修復的影響及機制研究.pdf

1、目的：小膠質(zhì)細胞介導的吞噬功能在脊髓損傷修復中起重要作用，既往研究顯示Rho/ROCK通路參與脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞炎癥反應，神經(jīng)元凋亡及軸突再生過程。本試驗旨在進一步研究Rho/ROCK通路對小膠質(zhì)細胞遷移及吞噬功能的影響，并進一步探討ROCK抑制劑對大鼠脊髓損傷后早期修復的影響及其機制。
　　方法：分別采用BV2細胞和大鼠脊髓原代小膠質(zhì)細胞用于體外實驗、自由落體打擊法建立大鼠脊髓損傷模型；流式細胞術(shù)檢測BV2細胞和原代小膠質(zhì)細胞

2、的吞噬功能；Transwell小室檢測原代小膠質(zhì)細胞遷移功能；免疫熒光法觀察細胞形態(tài)變化以及ROCK2、MBP的表達；ROCK活性試劑盒檢測ROCK激酶活性；Western Blot檢測ROCK2、MAPKs、IL-1β和TNFα的表達；透射電子顯微鏡檢測脊髓小膠質(zhì)細胞活化、遷移及吞噬功能；凋亡試劑盒檢測細胞凋亡；BBB評分評估運動功能的恢復。
　　結(jié)果：
　　1）BV2細胞表達小膠質(zhì)細胞特異性標記Iba1及ROCK2(10

3、0％)。Y27632和fasudil干預0.5,1,3h后，與對照組相比，ROCK激酶活性明顯降低（n=4,*p<0.01），各組LDH分泌無明顯差別（n=4, p>0.05）。
　　2）Y27632和fasudil干預后1h后，與對照組相比，F(xiàn)ITC-dextran（40000MW）吞噬率及平均熒光強度明顯增高（n=5,*p<0.01）。
　　3）Y27632和fasudil干預引起B(yǎng)V2細胞ERK磷酸化增加、JNK和p3

4、8磷酸化無明顯改變，此作用可以在干預0.5h出現(xiàn)，并一定程度持續(xù)存在（n=5,*p<0.01）。
　　4）U0126可抑制Y27632和fasudil引起的ERK磷酸化增加，并可抑制Y27632和fasudil引起的BV2細胞吞噬能力的增加（n=5,*p<0.01,＃p<0.05）。
　　5）Y27632和fasudil可引起B(yǎng)V2細胞形態(tài)變大，形態(tài)不規(guī)則以及多的細小的枝杈，U0126可逆轉(zhuǎn)上述形態(tài)改變。
　　6）小膠

5、質(zhì)細胞特異性標記Iba1顯示原代培養(yǎng)的大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞純度為98%以上，且均表達ROCK2(100%)。Y27632和fasudil干預后1h，與對照組相比，F(xiàn)ITC-dextran微粒吞噬率及平均熒光強度明顯增高（n=4,*p<0.01）。
　　7）Y27632和fasudil干預后6h，與對照組相比，小膠質(zhì)細胞遷移率明顯增高（n=4,*p<0.01,＃p<0.05）。
　　8）Y27632和fasudil干預引起原代小

6、膠質(zhì)細胞ERK磷酸化增加，此作用可以在干預1h出現(xiàn)，并一定程度持續(xù)存在（n=4,*p<0.01,＃p<0.05）。
　　9）U0126可抑制Y27632和fasudil引起的ERK磷酸化增加，并可抑制Y27632和fasudil引起的小膠質(zhì)細胞吞噬改變（n=4,*p<0.01,＃p<0.05）。
　　10）U0126可抑制Y27632和fasudil引起的ERK磷酸化增加，并可抑制Y27632和fasudil引起的小膠質(zhì)細胞

7、遷移功能改變（n=4,*p<0.01,＃p<0.05）。
　　11）Y27632和fasudil干預1h后，與對照組相比，小膠質(zhì)細胞形態(tài)即有明顯改變，表現(xiàn)為形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則，并伸出多個長的枝杈。U0126可抑制Y27632和fasudil引起的小膠質(zhì)形態(tài)改變。
　　12）在脊髓損傷后1,3和7d時，ROCK活性明顯增高，ROCK抑制劑fasudil可顯著抑制損傷脊髓ROCK活性（n=4,*P<0.01）。
　　13）透射

8、電鏡顯示ROCK抑制劑fasudil可促進小膠質(zhì)細胞吞噬功能，干預后灶周小膠質(zhì)細胞數(shù)目變多、形態(tài)變大，吞噬髓磷脂碎片增多，活化小膠質(zhì)細胞周邊殘存磷脂碎片及紅細胞減少。
　　14）TUNEL顯示 ROCK抑制劑 fasudil干預后1d時，組織細胞凋亡顯著減少（n=4,*P<0.01）。
　　15）MBP染色顯示脊髓損傷14d時，fasudil干預顯著減少脊髓損傷髓鞘缺損面積；BBB評分顯示，fasudil可以促進脊髓損傷運動