Rho-ROCK信號(hào)通路對Tca8113增殖活性、遷移、黏附力及侵襲力的影響.pdf

1、研究背景:
　　 在口腔頜面部腫瘤中,舌癌是常見的惡性腫瘤之一,生長迅速,早期淋巴轉(zhuǎn)移率高。患者就診時(shí),腫瘤常已經(jīng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲性。因舌體部位和功能的特殊性,手術(shù)治療常帶來發(fā)音或吞咽功能障礙,嚴(yán)重者容貌畸形,影響患者的身心健康,加之放、化療周期長,副作用大,患者術(shù)后生活質(zhì)量常明顯下降。目前,在求得手術(shù)治愈率提高的同時(shí),為了進(jìn)一步改善患者術(shù)后的生存質(zhì)量,分子水平的藥物治療已逐漸受到重視,越來越多的研究結(jié)果讓我們有希望看到分子治療

2、將成為腫瘤傳統(tǒng)治療方法的補(bǔ)充。Rho/ROCK信號(hào)通路是一個(gè)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架的重要通路,而細(xì)胞骨架廣泛參與細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換、信號(hào)傳遞和細(xì)胞分化等與生命現(xiàn)象相關(guān)的活動(dòng)過程。對該通路的研究將有助于口腔及腫瘤專家對舌癌侵襲機(jī)制的了解,并能對早期轉(zhuǎn)移做到及時(shí)治療。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究旨在通過應(yīng)用不同濃度的Y-27632--Rho/ROCK信號(hào)通路特異性抑制劑,作用于體外培養(yǎng)的人舌癌細(xì)胞株Tca8113,觀察該信

3、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被阻斷后,細(xì)胞增殖活性、運(yùn)動(dòng)能力、侵襲能力的改變,分析其結(jié)果并探討作用機(jī)制,為舌癌的侵襲轉(zhuǎn)移的治療或控制提供一種思路,并為Y-27632的作用機(jī)制提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:
　　 應(yīng)用Rho/ROCK信號(hào)通路特異性抑制劑Y-27632,作用于體外培養(yǎng)的Tca8113細(xì)胞,探討Rho/ROCK信號(hào)通路對該細(xì)胞增殖、黏附和侵襲過程的作用機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 選取正常生長的Tca

4、8113細(xì)胞接種、消化、計(jì)數(shù),并繪制細(xì)胞生長曲線；用不同濃度的Rho/ROCK信號(hào)通路特異性抑制劑Y-27632(5μM、10μM、25μM、50μM)作用于體外培養(yǎng)的Tca8113細(xì)胞,MTT法檢測不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖情況,計(jì)算抑制率；劃痕法測不同濃度藥物對細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響；細(xì)胞體外黏附實(shí)驗(yàn)觀察Y-27632對細(xì)胞黏附能力的影響；Transwell法檢測經(jīng)Y-27632預(yù)處理細(xì)胞的侵襲能力的改變。
　　 結(jié)果：
　　

5、 1體外培養(yǎng)的Tca8113的生長曲線近似S形,符合一般細(xì)胞的生長規(guī)律。生長至第3天時(shí)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)分裂期,可進(jìn)行傳代培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)；第7-8天時(shí)生長及分裂能力開始下降,形態(tài)變化,死亡細(xì)胞增多。
　　 2對照組的Tca8113細(xì)胞具有癌細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征。在倒置顯微鏡下呈“鋪路石”狀,細(xì)胞核大小不一,可呈圓形、卵圓形或腎形,核漿比例高,細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞呈巢狀或片狀活躍生長；而加入Y-27632干預(yù)后,隨濃度的高低細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的

6、形態(tài)及數(shù)量的變化。
　　 3相同時(shí)間,隨Y-27632濃度增大,Tca8113細(xì)胞490nm處吸光度值逐漸減小,具有劑量依賴趨勢,各實(shí)驗(yàn)組之間OD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而且抑制率依次增大；相同濃度,隨Y-27632作用時(shí)間的延長,增殖抑制率相應(yīng)增高。
　　 4 Y-27632作用24h后的對照組細(xì)胞向劃痕中央?yún)^(qū)大量爬行,傷口邊緣的細(xì)胞將“突觸”伸向劃痕中央的空白區(qū),并依靠這種方式彼此緊密連接,爬行覆蓋傷口

7、的細(xì)胞增生活躍,間距很小,傷口模型愈合良好。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的爬行能力隨Y-27632濃度的增加而依次下降,劃痕傷口愈合不良,細(xì)胞呈抑制狀態(tài),排列稀疏,間距較大,表明Tca8113細(xì)胞經(jīng)Y-27632處理后運(yùn)到能力受到負(fù)向影響。
　　 5對照組細(xì)胞與孔板黏附性能好,細(xì)胞數(shù)量多,形態(tài)飽滿,排列相對密集；而加入不同濃度的Y-27632預(yù)處理24h后,細(xì)胞黏附能力依次降低,OD值逐漸下降,25μM及50μM濃度組細(xì)胞數(shù)量明顯減少,排列稀疏,

8、呈“小黑點(diǎn)狀”。各濃度組之間OD值存在顯著差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),黏附率曲線呈下降趨勢。
　　 6 Y-27632預(yù)處理24h后的對照組細(xì)胞穿膜數(shù)量較多,隨抑制劑濃度增加,經(jīng)過處理的細(xì)胞變形能力逐漸減小,穿膜數(shù)量逐漸減少,50μM組為最少,各實(shí)驗(yàn)組與對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對照組變形穿膜后的細(xì)胞仍呈圓球形,分布均勻密集,部分細(xì)胞穿膜后仍有很強(qiáng)的生長、增殖能力；而5μM、10μM組細(xì)胞變形能力相對減