熊果酸對人舌癌Tca8113細胞增殖、凋亡的影響及機制的實驗研究.pdf

1、口腔癌是最常見的十大惡性腫瘤之一,而在我國口腔癌中,舌癌的發(fā)病率居第一位。舌癌生長快,惡性程度高,浸潤性較強。治療方法常是手術(shù)、放療、化療等的綜合治療,但患者的五年生存率仍然很低,探尋積極有效的預(yù)防途徑及有效的治療藥物顯得十分迫切和必要。
　　 熊果酸對多種致癌、促癌物有抵抗作用。體外實驗證實其可以抑制多種腫瘤細胞的增殖、誘導其凋亡。而熊果酸對口腔腫瘤的作用研究較少,而其對舌癌作用機制的研究,國內(nèi)外尚不多見。
　　 采用

2、體外培養(yǎng)人舌癌Tca8113細胞的方法,觀察熊果酸對其產(chǎn)生的作用。在此基礎(chǔ)上,采用MTT法,流式細胞術(shù)、電鏡觀察、免疫細胞化學技術(shù)、及RT—PCR、Western Blot等多種分子生物學技術(shù)觀察熊果酸對Tca8113細胞增殖、凋亡的影響并探討其發(fā)生機制。在體外實驗的基礎(chǔ)上,以Tca8113細胞株建立人舌癌裸鼠皮下移植瘤模型,應(yīng)用適當濃度的熊果酸進行治療,觀察熊果酸經(jīng)體內(nèi)代謝后對腫瘤的影響以及荷瘤裸鼠的毒性反應(yīng),并探討其發(fā)生機制,為舌癌

3、的治療尋找新的藥物,拓展新的思路和方法,為熊果酸在口腔癌治療中的開發(fā)、應(yīng)用提供實驗依據(jù)。本研究分為以下三個部分:
　　 方法:
　　 1.光學顯微鏡觀察未經(jīng)和經(jīng)熊果酸作用的Tca8113細胞的形態(tài)學變化。
　　 2.經(jīng)濃度為6.25、12.5、25、50μmol／L熊果酸培養(yǎng)液作用于人舌癌Tca8113細胞,分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72h后,采用四甲基偶氮唑藍(methylthiazolyl ter

4、azolium,MTT)比色法,檢測Tca8113細胞增殖活性的改變,觀察不同濃度熊果酸作用不同時間后對人舌癌Tca8113的毒性效應(yīng)。
　　 3.將濃度25μmol／L熊果酸培養(yǎng)液作用于人舌癌Tca8113細胞,分別培養(yǎng)0、24、48、72h后,應(yīng)用流式細胞術(shù)(Flow Cytometer,FCM)在功能水平上檢測人舌癌Tca8113細胞的凋亡率及細胞周期分布情況。
　　 4.應(yīng)用透射電鏡觀察經(jīng)25μmol／L熊果酸作

5、用72h的細胞超微結(jié)構(gòu)變化
　　 5.統(tǒng)計學處理:采用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((x)±s)表示。MTT法檢測結(jié)果采用兩因素方差分析,流式細胞術(shù)結(jié)果采用單因素方差分析,檢驗水準α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)熊果酸作用后的Tca8113細胞發(fā)生了形態(tài)學變化。
　　 2.熊果酸對Tca8113細胞有明顯的生長抑制作用,呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時間依賴性；不同

6、濃度組間、不同時間組間生長抑制率均有顯著性差異(P<0.01)。50μmol／L熊果酸作用72h后細胞生長抑制率達68.80％。
　　 3.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,隨熊果酸作用時間延長,Tca8113細胞凋亡率由2.57％增加至24.51％,有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。G2／M期細胞比例變化不明顯(P>0.05),而S期細胞比例逐漸降低(P<0.01),G0／G1期細胞比率明顯升高(P<0.01)。
　　 4.透射電鏡顯示

7、熊果酸作用后,細胞骨架破壞,核染色質(zhì)濃縮成塊,同時可見凋亡小體。
　　 方法:
　　 1.分別制作經(jīng)濃度25μmol／L熊果酸作用0、24、48、72h的細胞爬片,采用免疫細胞化學技術(shù)檢測細胞NF-κB、VEGF、bcl-2和Bax基因蛋白表達情況。
　　 2.將25μmol／L熊果酸作用于人舌癌Tca8113細胞0、24、48、72h后,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription—po

8、lymerase chainreaction,RT—PCR)技術(shù)檢測藥物作用后的Tca8113細胞中NF—κB、VEGF、bcl-2和Bax的mRNA表達情況,并對檢測結(jié)果進行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌細胞增殖及其促其凋亡的機制。
　　 3.將25μmol／L熊果酸作用于人舌癌Tca8113細胞0、24、48、72h后,采用Western Blot方法檢測藥物作用后的Tca8113細胞中NF-κB、VEGF、Bcl-2和

9、Bax基因蛋白表達情況,并對檢測結(jié)果進行半定量分析,進一步研究熊果酸抑制舌癌細胞增殖及其促其凋亡的機制。
　　 4.統(tǒng)計學處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((x)±s)表示,采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫細胞化學染色結(jié)果:NF-κB棕黃色著色在細胞核和細胞漿內(nèi)；VEGF棕黃色著色在細胞質(zhì)內(nèi)；Bcl-2、Bax棕黃色顆粒在細胞質(zhì)內(nèi)。

10、
　　 2.RT-PCR結(jié)果:經(jīng)熊果酸作用后,Tca8113細胞的NF-κB、VEGF、Bcl-2基因mRNA表達逐漸降低,Bax細胞因子mRNA表達逐漸升高,Bcl-2／Bax比例降低,且有時間依賴性。有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.Western blot檢測結(jié)果:經(jīng)熊果酸作用后,Tca8113細胞的NF-κB、VEGF、Bcl-2基因蛋白表達逐漸降低,Bax蛋白表達逐漸升高,且有時間依賴性。有統(tǒng)計學意義(

11、P<0.05)。
　　 方法:
　　 1.選用4-6w齡的BALB／C-nu／nu雌性裸小鼠12只,在其腋部皮下接種Tca8113細胞,建立裸鼠移植瘤模型。成瘤后隨機分為對照組和實驗組,每組6只,實驗組每d向腫瘤組織局部注射熊果酸,劑量為0.05mg／g體質(zhì)量；對照組注射同體積PBS(0.01M,pH7.4)。共治療4w。
　　 2.每d觀察裸鼠的精神、飲食及活動狀況。每w測量瘤體大小及裸鼠體重,進行藥物毒性評價

12、。
　　 3.治療結(jié)束時處死小鼠,剝除腫瘤稱重,計算抑瘤率。
　　 4.光學顯微鏡下觀察腫瘤組織及腦、心、肝、脾、腎等重要臟器。
　　 5.應(yīng)用RT—PCR技術(shù)檢測移植瘤中NF—κB、VEGF、bcl-2和Bax的mRNA表達情況,并對檢測結(jié)果進行半定量分析,以期了解熊果酸抑制舌癌細胞移植瘤機制。
　　 6.采用Western Blot方法檢測移植瘤中NF-κB、VEGF、Bcl-2和Bax基因蛋白表達情

13、況,并對檢測結(jié)果進行半定量分析,進一步研究熊果酸抑制舌癌細胞移植瘤增殖及其促其凋亡的機制。
　　 7.采用TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡情況,統(tǒng)計細胞凋亡指數(shù)。
　　 8.統(tǒng)計學處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((x)±s)表示。裸鼠體質(zhì)量變化及瘤體質(zhì)量變化分別采用獨立樣本的t檢驗和配對t檢驗。RT—PCR及Western Blot采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

14、>　　 結(jié)果:
　　 1.與對照組相比,實驗組腫瘤生長緩慢,隨注射熊果酸時間增長,腫瘤被抑制效果更加明顯。到治療結(jié)束時,兩組裸鼠移植瘤體積、瘤質(zhì)量均存在顯著性差異(P<0.05)。瘤質(zhì)量及瘤體積抑制率達到55.65％和61.72％。
　　 2.治療過程中,裸鼠未見明顯不良反應(yīng),治療結(jié)束時,各組裸鼠體質(zhì)量與治療前體質(zhì)量相比增加平穩(wěn),比值大于0.8,未見明顯毒性反應(yīng)。兩組裸鼠的重要臟器腦、心、肝、脾、腎等均未見器質(zhì)性改變及

15、瘤轉(zhuǎn)移等。
　　 3.光學顯微鏡下,實驗組腫瘤內(nèi)組織壞死崩解的面積明顯大于對照組,細胞形態(tài)的異形性比對照組小,可見核固縮等凋亡現(xiàn)象。
　　 4.RT—PCR技術(shù)檢測移植瘤中NF—κB、VEGF、bcl-2 mRNA表達下調(diào),Bax mRNA表達上調(diào),有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 5.Western Blot方法檢測移植瘤中NF—κB、VEGF、Bcl-2基因蛋白下調(diào),Bax基因蛋白表達上調(diào),有統(tǒng)計學意義(

16、P<0.05)。
　　 6.與對照組相比,實驗組腫瘤組織中凋亡細胞明顯增多,兩組AI分別為:1.63±0.30.17.39±2.78,組間有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 本研究前兩部分采用MTT方法、流式細胞術(shù)及電鏡技術(shù)檢測熊果酸對人舌癌Trca8113細胞增殖、凋亡、細胞周期的影響,采用免疫細胞化學技術(shù)、RT—PCR技術(shù)以及Western Blot免疫印跡等分子生物學技術(shù)檢測了熊果酸對人舌癌

17、Tca8113細胞基因NF—κB、VEGF、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表達的影響。第三部分采用上述部分方法進行熊果酸作用后的Tca8113裸鼠移植瘤的檢測,得出如下結(jié)論:
　　 1.熊果酸對人舌癌Tca8113細胞具有增殖抑制作用,并且呈時間劑量依賴性。
　　 2.熊果酸對人舌癌Tca8113細胞具有誘導凋亡作用,并且存在時間依賴性。
　　 3.熊果酸能下調(diào)人舌癌Tca8113細胞的NF—κB、VEGF、

18、Bcl-2 mRNA以及蛋白表達,能上調(diào)Bax表達,改變了Bcl-2／Bax的比例,且具有時間依賴性。此作用可能是其抑制細胞增殖的機制之一。
　　 4.熊果酸參與Tca8113細胞周期調(diào)控,使細胞阻滯于G0／G1期。熊果酸對細胞的增殖抑制、誘導凋亡及相關(guān)基因的抑制作用可能均與其G0／G1期阻滯有關(guān)。
　　 5.成功構(gòu)建了人舌癌Tca8113細胞裸鼠移植瘤模型,證實熊果酸能抑制舌癌移植瘤生長,且對機體無明顯毒、副作用。