Manumycin誘導(dǎo)舌鱗癌Tca8113細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制.pdf

1、舌癌為口腔內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占全身惡性腫瘤的1％，男性多于女性，病理類(lèi)型以鱗狀細(xì)胞癌為主，區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，治療采取手術(shù)為主的綜合治療。早期舌癌手術(shù)切除，中晚期舌癌傾向于手術(shù)、化療與放療的綜合應(yīng)用。由于頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶對(duì)放射不敏感，目前比較常用的治療方法是術(shù)前化療合并手術(shù)綜合治療。以外科治療口腔鱗狀細(xì)胞癌為例，治療失敗大多由于原發(fā)癌未被控制，其中，腫瘤不全切除和癌細(xì)胞的創(chuàng)面種植是造成局部復(fù)發(fā)的主要因素。如在術(shù)前給予一定劑量

2、的有效化療，以殺滅活躍生長(zhǎng)的癌細(xì)胞或降低其活性，既可為手術(shù)切除創(chuàng)造有利條件，又可能減少術(shù)后復(fù)發(fā)率。同時(shí)，該部位涉及咀嚼、味覺(jué)、發(fā)音及吞咽等功能，也是整容的重要部位，治療重點(diǎn)應(yīng)是保留器官和功能。化療在綜合治療中的應(yīng)用既迎合了最新的器官保留概念，維持器官功能上的完整性又力求在一定程度上提高病人的遠(yuǎn)期生存率。開(kāi)發(fā)新型低毒高效的舌癌化療藥物成為舌癌綜合治療的新重點(diǎn)。 Manumycin手霉素及相關(guān)化合物是發(fā)現(xiàn)于鏈絲菌培養(yǎng)液，直至1993

3、年始發(fā)現(xiàn)其有抑癌作用。目前已經(jīng)證實(shí)Manumycin的抑癌作用可通過(guò)抑制ras蛋白活化依賴(lài)性的法尼基轉(zhuǎn)移酶而產(chǎn)生，口腔鱗癌rasp21的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)82.05％～92.50％，而在正常鱗狀上皮組織中則無(wú)rasp21蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。Manumycin還可以通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)以及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的增值發(fā)揮抗癌作用，此外，其抑癌作用還與引起細(xì)胞活性氧升高有關(guān)。大量文獻(xiàn)報(bào)道頭頸鱗癌中表皮生長(zhǎng)因子受體的高表達(dá)，并有

4、學(xué)者已經(jīng)證實(shí)應(yīng)用不同濃度的表皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體EGFRmAb處理人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113能夠明顯抑制其增殖，且在較低濃度就可以發(fā)揮作用。同時(shí)舌鱗癌也是VEGF高陽(yáng)性表達(dá)的場(chǎng)所。Tca8113細(xì)胞是口腔最常見(jiàn)的鱗癌細(xì)胞，其rasp21的高陽(yáng)性表達(dá)率以及高表達(dá)的VEGF和EGFR成為Manumycin作用的重要靶點(diǎn)，顯示出Manumycin作用于舌鱗癌的良好前景。 Manumycin具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，但是其機(jī)制至今尚未報(bào)道

5、。本文主要報(bào)道Manumycin對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，探討其分別與順鉑、5-氟尿嘧、平陽(yáng)霉素、阿霉素聯(lián)合對(duì)Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用是否具有協(xié)同效應(yīng)并進(jìn)一步探討其體外是否具有誘導(dǎo)舌癌凋亡的作用及其機(jī)制，以期為今后體內(nèi)抗癌研究以及促進(jìn)新型抗舌鱗癌藥物的研究與開(kāi)發(fā)或者可能的新型臨床化療方案提供理論依據(jù)。 方法 MTT法測(cè)定Manumycin單藥以及分別與平陽(yáng)霉素、順鉑、阿霉素、5-氟脲嘧啶聯(lián)合作用

6、于Tca8113的細(xì)胞毒作用，聯(lián)合用藥細(xì)胞毒測(cè)定以ChouTC中效原理設(shè)計(jì)；Hoechst33258染色后熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)；AnnexinV染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)Manumycin誘導(dǎo)凋亡作用；細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和線(xiàn)粒體跨膜電位(△Ψm)分別用DCFH-DA和DiOC6熒光探針標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)；蛋白質(zhì)定量檢測(cè)Westernblot法。 結(jié)果 1Manumycin對(duì)Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Manumyci

7、n有較強(qiáng)的體外抗腫瘤作用，對(duì)Tca8113細(xì)胞的IC50為(11.33±0.63)μmol·L-1，表明Manumycin濃度依賴(lài)抑制Tca8113細(xì)胞的生長(zhǎng)，這種作用呈量效關(guān)系。聯(lián)合用藥顯示在相應(yīng)比例劑量條件下，Manumycin與順鉑聯(lián)合呈拮抗作用，與5-氟脲嘧啶聯(lián)合低濃度呈相互拮抗，高濃度聯(lián)合呈明顯協(xié)同作用，Manumycin與平陽(yáng)霉素、阿霉素聯(lián)合均呈相互協(xié)同的作用。 2細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變不同濃度Manumycin

8、處理細(xì)胞24h后細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的熒光濃染。正常對(duì)照組核形規(guī)則，染色均勻；當(dāng)Manumycin濃度高于20μmol·L-1時(shí)細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的濃染致密的顆粒塊狀熒光，并有典型的凋亡小體產(chǎn)生。 3Manumycin誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞的凋亡作用本研究證實(shí)Manumycin具有誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡的作用，其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率既是隨著Manumycin藥物濃度的增加而增加又是隨著藥物作用時(shí)間的增加而增加。5，10，20μmol·

9、L-1Manumycin分別作用Tca8113細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率分別為(7±2)％，(19±5)％和(36±8)％(n=3)；20μmol·L-1Manumycin分別作用于Tca8113細(xì)胞12，24，48h后，細(xì)胞凋亡率分別為(11±3)％，(35±7)％和(68±10)％(n=3)； 4Manumycin對(duì)Tca8113細(xì)胞內(nèi)ROS和△Ψm的影響以20μmol·L-1Manumycin分別處理Tca8113細(xì)胞12，

10、24和48h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和△Ψm的變化。Manumycin作用12h，即出現(xiàn)ROS明顯增加，MIF增加，峰值出現(xiàn)有意義的向右移動(dòng)，24h后繼續(xù)增加，至48h達(dá)到最大；而測(cè)定線(xiàn)粒體跨膜電位時(shí)，發(fā)現(xiàn)藥物作用于細(xì)胞株12和24h后線(xiàn)粒體跨膜電位有所降低，即MIF略有增加；作用48h后線(xiàn)粒體跨膜電位明顯降低，峰值明顯右移。Manumycin對(duì)Tca8113細(xì)胞內(nèi)ROS和△Ψm的影響基本一致，無(wú)顯著性差異。 5Manumycin誘導(dǎo)

11、Tca8113細(xì)胞caspase-3，9的活化引起凋亡通路的激活20μmol·L-1Manumycin分別作用于Tca8113細(xì)胞12，24，48h后，Caspase-3，9，出現(xiàn)不同程度裂解，并且在Manumycin作用48h后出現(xiàn)了明顯的裂解片斷，裂解程度與藥物作用時(shí)間長(zhǎng)短呈正比。進(jìn)一步檢測(cè)caspase激活底物PARP也發(fā)現(xiàn)在20μmol·L-1Manumycin不同時(shí)間的作用下也分別出現(xiàn)不同程度的降解，這表明，Manumycin

12、能夠誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一可能是引起caspase依賴(lài)性激活最終導(dǎo)致Tca8113細(xì)胞的凋亡。 6N-乙酰半胱氨酸抑制Manumycin誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡為了明確活性氧在凋亡事件中發(fā)揮的作用，以N-乙酰半胱氨酸作為活性氧清除劑參與Manumycin作用于Tca8113細(xì)胞后，觀測(cè)其核型及胞內(nèi)活性氧的變化。熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞核型可見(jiàn)細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理24h后，正常對(duì)照組核形規(guī)則，染色均勻。20μmol·L-1Manu

13、mycin藥物單獨(dú)處理組出現(xiàn)明顯的濃染致密塊狀熒光，可見(jiàn)凋亡小體產(chǎn)生，10mmol·L-1NAC單獨(dú)處理組與正常對(duì)照組類(lèi)似，同時(shí)加入Manumycin與NAC組個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)輕度深染，與正常對(duì)照組差別微小。流式細(xì)胞儀檢測(cè)24h后胞內(nèi)活性氧的變化顯示10mmol·L-1NAC單獨(dú)處理組與對(duì)照組相比ROS略降，20μmol·L-1Manumycin單獨(dú)處理組其ROS水平明顯升高，而同時(shí)加入Manumycin與NAC組其ROS水平顯著降低，降至

14、與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，提示Manumycin引起的活性氧的升高可以被活性氧清除劑清除進(jìn)一步確定Manumycin可以升高Tca8113細(xì)胞的活性氧水平，降低膜電位從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 結(jié)論 1Manumycin體外顯著抑制舌鱗癌Tca8113的生長(zhǎng)，呈量效關(guān)系，IC50為(11.33±0.63)μmol·L-1。Manumycin與平陽(yáng)霉素、阿霉素以及與5-氟脲嘧啶高濃度聯(lián)合作用于Tea8113細(xì)胞呈相互協(xié)同的細(xì)胞毒作用。