芪藍(lán)制劑對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞的抗增殖和促凋亡作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的：復(fù)方中藥芪藍(lán)制劑由黃芪、絞股藍(lán)、川芎和富硒綠茶配方而成，具有“健脾益氣、活血祛瘀、解毒止痛”之功效，可用于口腔某些疾病的防治。本研究采用芪藍(lán)制劑體外作用于人舌鱗癌細(xì)胞系 Tca8113細(xì)胞，通過觀察芪藍(lán)制劑對(duì)其增殖、細(xì)胞周期分布及凋亡等生物學(xué)行為的作用效應(yīng)，并探究其作用效應(yīng)與microRNA-21（miR-21）及其靶蛋白PTEN和PDCD4的關(guān)系。
　　方法：以體外培養(yǎng)人舌鱗癌系Tca8113細(xì)胞為模型，用1.56~25m

2、g/mL梯度濃度芪藍(lán)制劑處理Tca8113細(xì)胞12 h、24 h、48 h，以等體積不含芪藍(lán)制劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理相同時(shí)間為空白對(duì)照組，cell counting kit-8（CCK8）法檢測細(xì)胞活力改變，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡率，特異性莖環(huán)狀引物結(jié)合Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-21的相對(duì)表達(dá)量變化，以Western blot檢測PDCD4和PTEN蛋白的相對(duì)表達(dá)量變化。Lipofectamine?300

3、0瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21 mimic使Tca8113細(xì)胞過表達(dá)miR-21，芪藍(lán)制劑繼續(xù)處理24 h后，應(yīng)用相同的方法檢測細(xì)胞活力、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率，以及miR-21和PDCD4蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.芪藍(lán)制劑作用于Tca8113細(xì)胞后，CCK-8法結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，1.56~25 mg/mL范圍濃度藥物對(duì)其細(xì)胞活性均有抑制作用（P<0.05），且呈劑量依賴性，12h、24h及48h的IC50分

4、別為8.800 mg/mL、6.131 mg/mL、3.628 mg/mL，其體外增殖抑制作用隨干預(yù)時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)；
　　2.與空白對(duì)照組相比，不同濃度芪藍(lán)制劑作用于 Tca8113細(xì)胞12h或24h后，S期細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05），G0/G1期細(xì)胞比例顯著下降（P<0.05），G2/M期細(xì)胞比例無明顯變化（P>0.05）；
　　3.與空白對(duì)照組（4.71±1.65％）相比，3.12~25 mg/mL范圍濃度芪藍(lán)

5、制劑作用于Tca8113細(xì)胞24h后，出現(xiàn)明顯凋亡細(xì)胞群（15.04±1.67%至69.74±4.63%，P<0.05）；
　　4.與空白對(duì)照組相比，3.12~25 mg/mL范圍濃度芪藍(lán)制劑作用 Tca8113細(xì)胞24h后，miR-21的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05）；
　　5.與空白對(duì)照組相比，不同濃度芪藍(lán)制劑作用Tca8113細(xì)胞24h后，均明顯上調(diào)PDCD4和PTEN蛋白的相對(duì)表達(dá)量（P<0.05），且在6.25

6、mg/mL濃度下，PDCD4表達(dá)量最高（2.48±0.12倍），在12.5 mg/mL濃度下，PTEN表達(dá)量最高（1.51±0.06倍）；
　　6.設(shè)置不同比例的Lipofectamine?3000試劑與FAM-NC RNA用量，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞帶綠色熒光的比例及其平均熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示在Lipofectamine?3000:FAM-NC RNA=4.5μL:60nM比例下轉(zhuǎn)染效率最高；
　　7

7、.利用Lipofectamine?3000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21 mimic，構(gòu)建miR-21過表達(dá)Tca8113細(xì)胞模型，再應(yīng)用6.25mg/mL芪藍(lán)制劑處理24h，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-21+Qilan組中miR-21的表達(dá)量相對(duì)于NC RNA和NC RNA+Qilan組分別上調(diào)14倍和30倍（P<0.05）；CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示過表達(dá)miR-21部分降低芪藍(lán)制劑的抗增殖和促凋亡效應(yīng)，與 NC RNA+Qil

8、an組（55.75±3.63%）相比，miR-21+Qilan組細(xì)胞活性增至71.08±8.72%，但仍低于NC RNA組（97.83±5.63%，P<0.05），而細(xì)胞凋亡率從NC RNA+Qilan組的22.72±1.52%降至13.27±0.44%，但仍高于NC RNA組（P<0.05）；與之相似，Western blot結(jié)果顯示miR-21+Qilan組PDCD4的表達(dá)量介于NC RNA+Qilan組和NC RNA組之間（P<0

9、.05）；相反地，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示過表達(dá)miR-21對(duì)芪藍(lán)制劑的S期周期阻滯效應(yīng)無明顯影響（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.芪藍(lán)制劑對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞發(fā)揮抗增殖和促凋亡作用；
　　2.芪藍(lán)制劑對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞發(fā)揮S期周期阻滯作用；
　　3.芪藍(lán)制劑下調(diào)miR-21的表達(dá)，并上調(diào)其靶蛋白PDCD4和PTEN的表達(dá)；
　　4.芪藍(lán)制劑通過miR-21/PDCD4通路