環(huán)氧化酶-2抑制劑塞來昔布對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞侵襲性抑制作用的研究.pdf

1、舌癌是口腔癌中最常見的惡性腫瘤之一，近年來，舌癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。雖然現(xiàn)在舌癌的診斷和治療水平已有很大提高，但其5年生存率仍不高，究其因?yàn)?，侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致舌癌治療效果不佳和死亡的重要因素之一。由于舌體活動(dòng)頻繁，舌組織淋巴及血運(yùn)豐富，且舌癌多呈浸潤性生長，早期容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。隨著針對(duì)舌癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究，特別是分子生物學(xué)研究的進(jìn)展以及分子靶向治療在腫瘤治療中的應(yīng)用，探討與舌癌侵襲相關(guān)的因素，尋找有效、

2、特異的抑制手段并探討其作用機(jī)制，不僅有利于預(yù)防舌癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生，還能為臨床治療提供新的途徑。
　　 近年來流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長期服用非甾體類抗炎藥物(Non-steroidalantiinflammatory drugs，NSAIDs)的人群，其結(jié)直腸癌的發(fā)病率可明顯降低，并可降低結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移率和術(shù)后復(fù)發(fā)率。NSAIDs這種抑制惡性腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的作用主要與抑制環(huán)氧化酶-2(Cycloxygenase-2，COX-2)酶的活性有

3、關(guān)。研究表明，COX-2在包括頭頸癌在內(nèi)的許多組織和器官的惡性腫瘤，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，特別是在分化程度低的和伴有局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腺癌、鱗癌組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在來源于相同組織類型的不同癌細(xì)胞中COX-2的表達(dá)依據(jù)其腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的不同而異。有研究認(rèn)為，COX-2基因過表達(dá)可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，COX-2基因沉默可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。COX-2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制與腫瘤細(xì)

4、胞粘附分子、腫瘤細(xì)胞膜皺褶、片狀偽足形成以及細(xì)胞外基質(zhì)密不可分。近來研究發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2抑制劑可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)的表達(dá)及活性而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，成為研究預(yù)防惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)之一。
　　 本研究重點(diǎn)觀察COX-2抑制劑塞來昔布對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌(Human tonguesquamous cell carcinoma，HTSCC)Tca8113細(xì)胞侵

5、襲的抑制作用，初步探討COX-2及其抑制劑對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，為應(yīng)用選擇性COX-2抑制劑預(yù)防舌癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分 COX-2抑制劑塞來昔布對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲力抑制作用的研究
　　 取生長良好的Tca8113細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿約70％后，做細(xì)胞劃痕，再分別用0、10μmol/L的塞來昔布培養(yǎng)24 h，通過觀察遷移到劃痕區(qū)的細(xì)胞情況，宏觀反映塞來昔布對(duì)人舌

6、鱗癌Tca8113細(xì)胞的侵襲能力的影響。采用MTT檢測細(xì)胞活力的方法，檢測塞來昔布對(duì)Tca8113細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附能力的影響。采用Transwell小室細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)通過小室的細(xì)胞數(shù)，檢測不同濃度塞來昔布作用24 h后，Tca8113細(xì)胞的體外遷移能力變化，將Matrigel膠平鋪于Transwell侵襲小室底，人工重組細(xì)胞基底膜，模擬腫瘤細(xì)胞的體外侵襲過程來檢測不同濃度塞來昔布作用24 h后，對(duì)Tca8113細(xì)胞侵襲性的影響。

7、劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Tca8113細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，COX-2抑制劑塞來昔布對(duì)Tca8113細(xì)胞的侵襲具有抑制作用。細(xì)胞-基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著作用濃度的增加，塞來昔布對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113與基質(zhì)黏附的抑制作用顯著增強(qiáng)，當(dāng)采用較高濃度的塞來昔布(20 μmol/L)作用細(xì)胞24 h后，Tca8113細(xì)胞對(duì)Matrigel的黏附能力明顯減弱，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而較低濃度組(5 μmol/L)則抑制

8、作用較弱，對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，孵育24 h后，Tca8113細(xì)胞在Boyden趨化小室中遷移，較低濃度組(5 μmol/L)細(xì)胞遷移數(shù)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.052)，而較高濃度組(10、20 μmol/L)細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均=0.000)。人工重組基底膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：塞來昔布組通過聚碳酸酯膜的Tca8113細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組細(xì)胞明顯減少，與

9、對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，塞來昔布以5、10、20 μmol/L濃度作用后24 h后，透過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為132.7±6.0(P=0.073)、68.3±6.5(P=0.000)和37.7±4.5(P=0.000)。
　　 第二部分 塞來昔布通過下調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9表達(dá)抑制Tca8113細(xì)胞侵襲作用
　　 取生長狀態(tài)良好的Tca8113細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后，分別加入含有不同濃度塞來昔布的培養(yǎng)液，其

10、藥物終濃度分別為0、5、10、20、40 μ mol/L，培養(yǎng)24、48 h后，采用MTT方法測定細(xì)胞的OD值，檢測塞來昔布對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞增殖的抑制作用；不同濃度的塞來昔布作用于Tca8113細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察不同濃度塞來昔布對(duì)Tca8113細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)的影響；含0、5、10、20 μmol/L塞來昔布的培養(yǎng)液培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞2

11、4 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)明膠酶譜法(Gelatin zymography)檢測不同濃度塞來昔布對(duì)Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9活性的影響。結(jié)果：MTT法檢測結(jié)果顯示，塞來昔布對(duì)Tca8113細(xì)胞的生長抑制作用隨其濃度增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長而增強(qiáng)，培養(yǎng)24 h后，10～40 μmol/L塞來昔布對(duì)Tca8113細(xì)胞產(chǎn)生明顯的生長抑制作用，其中40 μmol/L組對(duì)細(xì)胞的生長抑制率達(dá)82.2％；作用48 h后，20

12、、40 μmol/L塞來昔布對(duì)細(xì)胞的生長抑制分別達(dá)71.7％和91.6％。RT-PCR電泳結(jié)果顯示，較低濃度的塞來昔布對(duì)MMP-2抑制作用較弱，5 μmol/L組與對(duì)照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.295)，而10、20 μmol/L組Tca8113細(xì)胞MMP-2表達(dá)量與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。對(duì)MMP-9表達(dá)量結(jié)果顯示，即使較低濃度，塞來昔布對(duì)MMP-9 mRNA的表達(dá)量也有明顯抑制作用，當(dāng)以5、10、20 μmo

13、l/L的塞來昔布處理24 h后，均可顯著抑制MMP-9 mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比，其表達(dá)量降低差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。明膠酶譜檢測結(jié)果顯示，10、20μmol/L濃度的塞來昔布對(duì)Tca8113細(xì)胞MMP-2、MMP-9活性均有抑制作用，且隨濃度增加而增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均=0.000)。而5 μmol/L塞來昔布組，對(duì)MMP-2的活性抑制作用不明顯(P=0.054)，但對(duì)MMP-9的活性有明顯的抑制作