選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑塞來昔布抗膀胱腫瘤作用的體外實驗研究和臨床初步研究.pdf

1、膀胱腫瘤是我國泌尿外科最常見的腫瘤，其中多數(shù)為非肌層浸潤性膀胱癌。膀胱腫瘤的主要特點是復發(fā)率高，可能的原因是膀胱腫瘤患者膀胱粘膜局部免疫功能低下、使得殘存腫瘤容易逃避免疫監(jiān)視，得以生存和形成復發(fā)。因此，非肌層浸潤性膀胱腫瘤術后常輔以膀胱灌注化療或免疫療法以預防腫瘤復發(fā)和進展?？ń槊?BacillusCalmette-Guerin，BCG)是目前最有效的免疫治療，有效激活膀胱粘膜局部免疫應答是其抗腫瘤作用的主要機制，但BCG膀胱灌注等治療

2、仍不能完全預防腫瘤的復發(fā)和進展。預防膀胱腫瘤復發(fā)和進展仍是尚未完全解決的難題。 近年來，環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase，COX-2)逐漸成為膀胱腫瘤研究領域的研究熱點。研究表明，COX-2在正常人膀胱上皮細胞中幾乎無表達，在人膀胱腫瘤細胞中表達則顯著增強，它與腫瘤的分化、凋亡、血管生成等生物學行為有關，且與腫瘤分級分期、進展預后等有關。因此，COX-2可以作為膀胱腫瘤治療的新靶點。 有關COX-2與膀胱腫瘤的研

3、究是本實驗室近年來的研究重點之一。本課題通過研究選擇性COX-2抑制劑塞來昔布對BCG感染的人臍血源性樹突狀細胞(Cord bloodderived dendritic cell，CBDC)體外抗膀胱腫瘤免疫功能及對人膀胱腫瘤細胞株T24的體外增殖和凋亡的影響，探討塞來昔布的抗膀胱腫瘤效應及其可能機制，并通過一個小規(guī)模臨床研究，初步了解塞來昔布對BCG膀胱灌注治療非肌層浸潤性膀胱腫瘤的潛在的輔助治療效果。 本研究主要研究內容及結

4、果如下： 第一部分，塞來昔布對BCG感染的人CBDC體外抗膀胱腫瘤免疫功能的影響 1．首先，從人臍血中分離單個核細胞，體外誘導培養(yǎng)為樹突狀細胞(DC)，BCG刺激使其成熟。經鑒定所培養(yǎng)細胞具有典型DC形態(tài)學和表型特征。 2．分別加入培養(yǎng)基(空白對照)、BCG、BCG+PGE<,2>、BCG+塞米昔布等與DC共培養(yǎng)。ELISA法測定各組培養(yǎng)上清中Th1型細胞因子(IL-12)和Th2型細胞因子(IL-10)水平，結

5、果顯示BCG可同時增加DC的IL-12和IL-10分泌，提示無免疫漂移作用發(fā)生，而塞來昔布劑量依賴性地顯著增強BCG感染DC的IL-12的表達，抑制其IL-10表達：PGE<,2>的作用與此相反，提示塞來昔布可誘導偏向Th1型而PGE<,2>可誘導偏向Th2型免疫應答的免疫漂移作用。 3．MTT法測定各組DC的混合淋巴細胞反應性(MLR)，結果顯示塞來昔布顯著增加、而PGE<,2>則明顯抑制BCG感染的DC的混合淋巴反應性。

6、 4．乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定各組DC：激活的細胞毒T淋巴細胞(CTL)對人膀胱腫瘤細胞株T24的細胞毒活性。結果顯示，塞來昔布顯著增強、而PGE<,2>則明顯抑制BCG感染的DC激活CTL的抗膀胱腫瘤細胞毒活性。 第二部分，研究塞來昔布對人膀胱腫瘤細胞株T24體外增殖和凋亡的影響 1．將貼壁生長的T24細胞，分別與不同濃度塞來昔布、PGE<,2>以及PI-3K抑制劑LY294002共培養(yǎng)，MTT法測定塞米

7、昔布及PGE<,2>對T24細胞增殖活性的影響；分別與CM，DMSO(0.1％)，塞來昔布、PGE2以及LY294002共培養(yǎng)，流式細胞儀測定塞來昔布及PGE<,2>處理后T24細胞的凋亡率。結果顯示塞來昔布呈劑量依賴性顯著抑制貼壁生長的T24細胞的增殖，增加T24細胞的凋亡；而PGE<,2>和對貼壁生長的T24細胞增殖和凋亡無明顯影響。 2．建立細胞懸浮培養(yǎng)體系，將懸浮生長的T24細胞，分別與(2M，DMSO，塞來昔布、PGE

8、<,2>以及LY294002共培養(yǎng)，流式細胞儀測定塞米昔布及PGE<,2>處理后T24細胞的凋亡率(失巢凋亡，即脫壁作用誘導的凋亡現(xiàn)象)；分別與塞來昔布、PGE<,2>共培養(yǎng)，Western blot法檢測塞來昔布及PGE<,2>對PI-3K/Akt途徑活化的影響。結果表明，塞來昔布和LY294002顯著增加T24的失巢凋亡，而PGE<,2>顯著抑制T24細胞的失巢凋亡。Western blot結果提示，塞來昔布抑制、而PGE<,2>明

9、顯增加Akt磷酸化，提示塞來昔布和PGE<,2>對PI-3K/Akt途徑活化分別具有降低或增強作用，并且這種作用可能是對失巢凋亡的增強或抑制作用機制之一。 第三部分，口服塞來昔布膠囊對BCG膀胱灌注治療非肌層浸潤性膀胱腫瘤療效影響的臨床初步研究。 42例非肌層浸潤性膀胱癌術后患者隨機分為2組，分別接受單純BCG治療和BCG膀胱灌注加塞來昔布膠囊口服聯(lián)合治療。ELISA法測定治療前后尿液細胞因子水平，觀察復發(fā)和進展以及治療

10、相關副作用等情況，分析影響對塞米昔布治療的反應性的因素。結果顯示： 1．兩組患者治療前尿液IL-12、IL-10水平的差異無顯著性統(tǒng)計學意義，治療后聯(lián)合治療組IL-12水平以及其治療前后增加值均顯著高于單純BCG組，而治療后IL-10水平以及其治療前后增加值均顯著低于單純BCG組，提示塞來昔布可誘導BCG激活的膀胱局部免疫應答發(fā)生偏向Th1型的免疫漂移，從而增強膀胱局部的抗腫瘤免疫功能。 2．由于隨訪時間較短，目前尚

11、不能得出塞米昔布對BCG膀胱灌注預防膀胱腫瘤復發(fā)和進展療效影響的準確結論。 3．單純BCG治療組與聯(lián)合治療組比較，治療副作用無明顯差異。 4．對尿液細胞因子水平進行的預后因素影響分析結果提示：65歲以上年齡組對塞來昔布治療的反應性強于65歲以下年齡組；男性患者治療反應性強于女性患者；高分期、分級以及多發(fā)、直徑大的腫瘤治療反應性降低。其機制有待研究。 全文結論： 1．塞來昔布可增強BCG激活的Th1型免疫應

12、答，抑制Th2型應答，誘導向Th1型應答漂移，從而增強BCG激活的抗腫瘤免疫效應。其機制是通過抑制COX-2活性下調PGE<,2>的表達，從而抑制PGE<,2>誘導的DC的Th2型細胞因子IL-10分泌及其對Th1型細胞因子IL-12的拮抗作用，使得IL-12表達升高。 2．塞來昔布具有雙重抗腫瘤作用，即對BCG激活的免疫應答的增強作用，以及直接對膀胱腫瘤細胞增殖的抑制作用和凋亡的誘導作用。兩種作用均與塞來昔布對COX-2的抑制