一氧化氮在口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞中作用的研究.pdf

1、口腔頜面部惡性腫瘤約占全身惡性腫瘤的5.6％，根治性手術(shù)切除仍然是最重要和最有效的治療手段，然而，晚期、復(fù)發(fā)或已轉(zhuǎn)移的頭頸癌患者預(yù)后往往很差，據(jù)報道平均生存期僅6個月左右，局部復(fù)發(fā)率達(dá)到50％。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多危險因素與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是突變事件引發(fā)口腔鱗癌的機(jī)制仍然不清。越來越多的證據(jù)表明，慢性炎癥過程中由氧化還原作用引起的DNA損傷是口腔鱗癌發(fā)生的重要原因之一。 一氧化氮(nitricoxide，NO)是一種不

2、穩(wěn)定的自由基分子，參與了眾多的病理生理過程。由于NO具有氧化還原特性，近年來NO在腫瘤生物學(xué)中的作用受到了極大關(guān)注。內(nèi)源性NO主要由三型一氧化氮合酶(NOS)合成，每一型NOS都有特定的編碼基因。iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)是催化精氨酸產(chǎn)生NO的三種酶中的關(guān)鍵酶。iNOS在各種生理學(xué)(血壓調(diào)節(jié)，損傷修復(fù)和機(jī)體防御機(jī)制)和病理學(xué)(炎癥，感染，腫瘤，肝壞死及糖尿病)中扮演著重要角色。iNOS是與惡性腫瘤關(guān)系最密切的一種同工酶。然而，iNO

3、S在腫瘤發(fā)生中的作用是復(fù)雜的，其機(jī)理尚未徹底闡明。初步認(rèn)為，iNOS是促進(jìn)還是阻止腫瘤發(fā)展，取決于其在局部微環(huán)境的濃度水平。尤其是惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，都是iNOS起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。因此，利用iNOS活性進(jìn)行治療干預(yù)具有重大意義。 人類的各種惡性腫瘤中，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤等，都能見到iNOS表達(dá)。較鄰近的正常組織，大多數(shù)腫瘤組織iNOS有更高的表達(dá)和活性。然而，也有人認(rèn)為，人類腫瘤中iN

4、OS高表達(dá)并不是廣泛的現(xiàn)象。盡管頭頸鱗癌組織中也存在NOS表達(dá)或活性增高，但是NO在口腔鱗癌生成和轉(zhuǎn)移中的作用仍知之甚少。 CDDP被廣泛用于各種頭頸部惡性腫瘤的治療，體外藥物敏感性檢測結(jié)果表明，CDDP對口腔鱗癌的中度以上敏感率達(dá)到44.04％。盡管如此，仍有50％以上的患者對CDDP耐藥!因而，對NO聯(lián)合CDDP分子耐藥的研究，將有利于提高口腔頜面部惡性腫瘤臨床化療的效果，也有利于口腔頜面外科工作者繼續(xù)尋找治療OSCC的最佳

5、方案 本課題由三部分組成，集中研究了NO在口腔鱗癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和治療過程中的雙重作用及相關(guān)機(jī)制。 第一部分：一氧化氮誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡和P53蛋白表達(dá)的實驗研究 研究外源性一氧化氮(NO)對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用及可能機(jī)制。硝普鈉(SNP)作為NO的供體，用不同時間和不同濃度SNP處理細(xì)胞。采用MTT法檢測NO對細(xì)胞的生長抑制，丫啶橙染色、Wright-Giemsa染色、流式細(xì)胞儀、瓊脂糖凝膠電

6、泳觀察細(xì)胞凋亡作用，蛋白電泳法分析凋亡機(jī)制。結(jié)果可見，NO對Tca8113細(xì)胞的抑制作用呈劑量和時間依賴性。SNP處理細(xì)胞后，DNA、RNA合成減弱；細(xì)胞形態(tài)學(xué)出現(xiàn)凋亡的特征性改變；電泳可見典型的DNALadder形成；流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，隨著SNP濃度增高，凋亡細(xì)胞隨之增加，并出現(xiàn)G2/M期阻滯；Westernblot顯示，隨著SNP濃度增高，P53蛋白表達(dá)水平上調(diào)。本研究表明，外源性NO對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞有細(xì)胞增殖抑制和誘

7、導(dǎo)凋亡作用，腫瘤抑制基因P53介入了硝普鈉引起的凋亡調(diào)控作用。 第二部分：iNOS基因轉(zhuǎn)染舌癌細(xì)胞及穩(wěn)定細(xì)胞株的建立 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將真核表達(dá)載體pCMV-iNOS轉(zhuǎn)染入舌癌細(xì)胞Tca8113，得到高表達(dá)iNOS的細(xì)胞pCMV-iNOS/Tca，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的細(xì)胞pCMV/Tca，并以0.7％凝膠電泳和Westernblot方法鑒定轉(zhuǎn)染效果。MTT比色繪制生長曲線；一氧化氮酶法試劑盒測定培養(yǎng)上清液中的NO濃度；流式細(xì)胞

8、儀檢測細(xì)胞周期分布，計算細(xì)胞的增殖指數(shù)。結(jié)果表明，pCMV-iNOS質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切后分別得到預(yù)期的307bp、3628bp和5409bp三條線性條帶。經(jīng)G418篩選兩周后，蛋白電泳選出iNOS蛋白表達(dá)最強(qiáng)的細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到高表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞pCMV-iNOS/Tca。三種細(xì)胞培養(yǎng)48h后，測定上清液中NO的濃度，Tca組，pCMV-iNOS/Tca和PCMV/Tca組分別為121.74±39.45μmol/L，268.

9、12±87.16μmol/L和115.53±32.24μmol/L。與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空白載體組比較，pCMV-iNOS/Tca組的細(xì)胞生長速度比Tca組快，但差異無顯著性(P＞0.05)。pCMV-iNOS/Tca、Tca和pCMV/Tca細(xì)胞的增殖指數(shù)PI分別為0.50、0.39和0.32，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，(P＜0.05)。本研究結(jié)果表明，能成功建立穩(wěn)定高表達(dá)iNOS的舌癌細(xì)胞pCMV-iNOS/Tca，該細(xì)胞能持續(xù)釋放較高濃度

10、的NO，并顯示較強(qiáng)的體外增殖能力。 第三部分：iNOS在CDDP誘導(dǎo)舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113凋亡中的作用及其對細(xì)胞粘附、移行和體內(nèi)成瘤能力的影響 采用瓊脂糖凝膠電泳和流式細(xì)胞學(xué)，觀察了CDDP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用；細(xì)胞劃痕實驗，觀察了三種細(xì)胞運動能力；利用裸鼠移植瘤觀察了細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力；Westernblot和瘤體組織免疫熒關(guān)染色探討了E-cadherin,P27,P53和iNOS的表達(dá)變化。結(jié)果表明，CDDP對三種細(xì)胞

11、都有誘導(dǎo)凋亡作用，瓊脂糖凝膠電泳可見典型的DNALadder形成，但流式細(xì)胞儀PI染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)凋亡率無明顯差異；細(xì)胞劃痕后，Tca、pCMV-iNOS/Tca和pCMV/Tca三組細(xì)胞運動遷移能力無明顯差別；與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空白載體組比較，pCMV-iNOS/Tca組的細(xì)胞生長速度比Tca組快(P＞0.05)，細(xì)胞周期中G2/M和S期比例增加(P＜0.05)。體內(nèi)成瘤能力試驗結(jié)果顯示，pCMV-Tca、pCMV-iNOS/Tca組和Tc

12、a組平均瘤重(g)分別為1.1±0.24、2.5±0.48和1.3±0.32，pCMV-iNOS/Tca組的成瘤力顯著高于pCMV-Tca和Tca組(P＜0.01)；L-NAME作用后，iNOS表達(dá)水平下調(diào)，但E-cadherin表達(dá)水平幾乎未受影響；CDDP作用后，出現(xiàn)了E-cadherin和P27蛋白水平下降，P53蛋白上調(diào)；瘤體組織免疫熒關(guān)染色法也驗證了E-cadherin的表達(dá)變化。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染iNOS后的pCMV-iN

13、OS/Tca細(xì)胞，具有更強(qiáng)的體外增值能力和體內(nèi)致瘤能力，但對細(xì)胞運動無明顯影響。同時提示，CDDP對轉(zhuǎn)染前后的舌癌細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡作用，但細(xì)胞的粘附力減弱了；iNOS不能促進(jìn)CDDP誘導(dǎo)Tca8113凋亡作用，但E-cadherin,P27和P53蛋白在凋亡中發(fā)揮了作用。 綜上，本研究結(jié)果表明，NO在口腔鱗癌發(fā)生中的作用是復(fù)雜的、多方面的。一方面，以藥物為供體，外源性NO對人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞有細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用。