Cathepsin V參與HMGB1促進血管新生作用.pdf

1、目的:探討HMGB1促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管新生的作用機制以及內(nèi)源性蛋白酶對其促血管新生作用的調(diào)控。
　　方法:采用內(nèi)皮細胞成管功能分析不同干預藥物對內(nèi)皮細胞成管功能的促進或抑制作用。采用蛋白質(zhì)印記法檢測細胞內(nèi)外蛋白水平的變化。采用細胞免疫熒光染色法檢測細胞內(nèi)蛋白水平及細胞膜表面受體水平。采用重組HMGB1、蛋白酶抑制劑SID26681509、HMGB1-TLR4/MD2抑制劑Tetramer、TLR4抑制劑viper、Erk磷酸

2、化抑制劑U0126、沙奎那韋等藥物干預人臍靜脈內(nèi)皮細胞以評價內(nèi)皮細胞成管功能及細胞蛋白表達變化。通過藥物刺激和siRNA干擾的方法研究基因及蛋白作用:
　　(1)應用蛋白酶抑制劑SID抑制蛋白酶cathepsinⅤ的作用;
　　(2)應用Tetramer抑制HMGB1-TLR4特異性信號轉(zhuǎn)導;
　　(3)應用viper抑制與TLR4有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導;
　　(4)應用U0126抑制細胞內(nèi)Erk磷酸化過程;
　　

3、(5)應用siRNA干擾細胞內(nèi)HMGB1等蛋白的表達。
　　結(jié)果:研究發(fā)現(xiàn)缺氧過程中內(nèi)皮細胞核內(nèi)的HMGB1大量移位、釋放到細胞外。rHMGB1（1μg/ml）促進內(nèi)皮細胞成管功能，siRNA干擾HMGB1表達后，內(nèi)皮細胞成管功能下降。rHMGB1促進內(nèi)皮細胞ERK磷酸化，且其作用呈現(xiàn)雙相，即短時效應（30分鐘內(nèi)）和長時效應（3小時以上）。ERK磷酸化抑制劑U0126抑制內(nèi)皮細胞的成管功能。
　　rHMGB1刺激后的內(nèi)皮細胞

4、表面TLR4表達增加。TLR4抑制劑Viper可以抑制內(nèi)皮細胞的成管功能及ERK磷酸化。HMGB1-TLR4/MD2作用的特異性抑制劑Tetramer同樣能抑制內(nèi)皮細胞的成管功能及ERK磷酸化。Viper及Tetramer均能抑制rHMGB1與內(nèi)皮細胞的結(jié)合。
　　缺氧環(huán)境下，內(nèi)皮細胞中的CathepsinⅤ釋放到細胞外，且rHMGB1刺激時其釋放增加。HMGB1-TLR4/MD2特異性抑制劑Tetramer及ERK磷酸化抑制劑U

5、0126均可抑制CathepsinⅤ的釋放。CathepsinⅤ的抑制劑SID抑制內(nèi)皮細胞成管及HMGB1誘導的內(nèi)皮成管及ERK磷酸化，但并不影響rHMGB1與內(nèi)皮細胞的結(jié)合。
　　Saquinavir抑制內(nèi)皮細胞成管。在不同的時間點(6h，12h，24h)，Saquinavir能夠抑制CathepsinⅤ的釋放。類似于SID，Saquinavir能抑制內(nèi)皮細胞ERK磷酸化過程但不抑制rHMGB1與內(nèi)皮細胞的結(jié)合。
　　結(jié)論