基于HMGB1探討HBOA抗肝纖維化的作用機(jī)制.pdf

1、目的:復(fù)制大鼠四氯化碳肝纖維化模型，測(cè)定血清中高遷移率族蛋B1(HMGB1)與肝纖維化大鼠相關(guān)指標(biāo)的含量并驗(yàn)證其關(guān)系，觀察HMGB1對(duì)其胞外受體—Toll-4樣受體(TLR4)的激活作用，通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路探索HMGB1在肝纖維化形成中的作用，從而探討老鼠簕生物堿A（HBOA）抗肝纖維化的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、復(fù)制大鼠肝纖維化模型及藥物干預(yù)
　　取60只Sprague Dawley(SD)雄性大鼠隨機(jī)分為肝纖維

2、化模型組(n=50)及正常對(duì)照組(n=10)。肝纖維化模型組大鼠灌胃予以40％CCl4橄欖油溶液3 mL·kg-1復(fù)制肝纖維化模型，首劑加倍，每周2次，共12周，正常對(duì)照組大鼠僅灌胃相應(yīng)體積生理鹽水。第8周，隨機(jī)取部分大鼠作病理檢測(cè)，確定模型成功后將肝纖維化模型組大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(MC)、秋水仙堿組（Colchicine，0.4 mg·kg-1）、HBOA高劑量組(HBOA-H，100mg·kg-1)、HBOA低劑量組(HBOA-

3、L，50 mg·kg-1)，每組各10只。從第9周始，分別灌胃給予相應(yīng)的藥物，模型對(duì)照組及正常對(duì)照組(NC)灌胃給予相等體積的0.6％CMC-Na溶液10 mL·kg-1，每天1次，連續(xù)4周。
　　2、測(cè)定大鼠血清學(xué)指標(biāo)
　　于末次給藥24小時(shí)后，麻醉、稱重并腹主動(dòng)脈抽血，離心取上清液。檢測(cè)肝功能指標(biāo)谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(T-BIL)的活性;測(cè)定氧化應(yīng)激物超氧化物歧化酶(SOD

4、)活性、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)含量;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中炎癥因子HMGB1、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）;肝纖維化四項(xiàng)因子透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ);作HMGB1與其他指標(biāo)的相關(guān)回歸分析。
　　3、大鼠肝組織病理及分子生物學(xué)檢測(cè)<

5、br>　　大鼠處死后，取完整肝臟，電子天平精密稱重并計(jì)算大鼠肝指數(shù)，剪取相同部位肝左葉制作肝組織病理學(xué)切片，作常規(guī)HE、Masson染色，光鏡下觀察其病理變化并計(jì)算肝臟病理分級(jí)及評(píng)分;采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HMGB1、TLR4、肌動(dòng)蛋白α(α-SMA)蛋白的表達(dá);RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝組織HMGB1、TLR4、骨髓樣分化因子88(MyD88)、核因子kappa B(NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的mRNA表達(dá)。

6、>　　結(jié)果:
　　1、HBOA對(duì)CCl4性肝纖維化大鼠相關(guān)指標(biāo)的作用
　　8周后即成功復(fù)制CCl4性大鼠肝纖維化模型，連續(xù)給藥4周后發(fā)現(xiàn)，與模型對(duì)照組比較，HBOA可降低CCl4性肝纖維化大鼠血清中的ALT、AST及T-BIL(P＜0.01)，升高SOD、GSH-Px含量并降低MDA(P＜0.01)，降低炎癥因子HMGB1、IL-1β、IL-6、TNF-α水平(P＜0.01)，同時(shí)下調(diào)血清中的HA、LN、Col-Ⅳ、PCⅢ水

7、平(P＜0.01);且血清中HMGB1水平與其他因子呈顯著正相關(guān);HE及Masson病理結(jié)果顯示，HBOA顯著減輕CCl4所致肝組織病變程度。
　　2、HBOA抑制HMGB1在TLR4信號(hào)通路中的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)法測(cè)定結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組肝組織中HMGB1、TLR4、α-SMA蛋白的表達(dá)明顯升高(P＜0.01);與模型對(duì)照組比較，HBOA高、低劑量組均顯著降低肝組織中的HMGB1、TLR4、α-SMA

8、蛋白的表達(dá)（P＜0.01）。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肝組織中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1的mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.01);與模型對(duì)照組比較，HBOA高、低劑量組均顯著降低肝組織中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1的mRNA表達(dá)(P＜0.01)。
　　結(jié)論:HBOA對(duì)CCl4性大鼠肝纖維化有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能與降低晚期致炎因子H