葡萄籽提取物抗砷誘導(dǎo)肝纖維化的作用機(jī)制.pdf

1、大量職業(yè)研究、流行病學(xué)研究和實(shí)驗研究證實(shí)，慢性砷(arsenic，As)暴露可導(dǎo)致反復(fù)或持續(xù)的肝臟慢性炎癥、壞死，在修復(fù)過程中肝細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與降解失衡，ECM大量沉積，形成肝臟纖維化。雖然砷與肝纖維化之間的關(guān)系已經(jīng)確定，但其具體機(jī)制仍不明確。目前認(rèn)為氧化損傷是砷致肝纖維化的重要機(jī)制之一，認(rèn)為過量產(chǎn)生的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)激活肝星狀細(xì)胞(hep

2、atic stellate cells，HSCs)，并刺激其增殖、分化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)。而HSCs為ECM的主要來源細(xì)胞，HSCs的激活是肝纖維化形成的重要環(huán)節(jié)。在肝纖維化形成過程中，轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-beta，TGF-β）是重要的促纖維化細(xì)胞因子，其促纖維化的作用主要通過TGF-β/smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。目前很多抗肝纖維化的治療主要致力于阻斷

3、TGF-β/Smad信號通路、抑制HSCs的活性。
　　氧化損傷在砷暴露致肝損傷及肝纖維化中的作用提示，抗氧化、減輕氧化應(yīng)激能抑制砷誘導(dǎo)的肝臟損傷。因此，探尋安全有效的抗氧化物質(zhì)成為目前研究的熱點(diǎn)。葡萄籽提取物（grape seed extract，GSE）富含多酚類物質(zhì)，包括兒茶素、表兒茶素和原花青素，具有強(qiáng)大的抗氧化抗炎能力。GSE在體內(nèi)通過直接清除ROS和降低組織中炎癥反應(yīng)發(fā)揮其抗氧化和抗炎作用，其抗氧化能力大于維生素C、維

4、生素E及β胡蘿卜素。因此，本研究提出科學(xué)假說:GSE能減輕砷誘導(dǎo)的氧化損傷，對砷誘導(dǎo)的肝臟損傷及纖維化有保護(hù)作用。
　　為驗證和闡釋上述假說，本研究擬通過體內(nèi)和體外實(shí)驗達(dá)到兩個目標(biāo):第一，驗證補(bǔ)充GSE能否抑制慢性砷暴露誘導(dǎo)的肝損傷及纖維化。第二，探討GSE保護(hù)砷誘導(dǎo)肝損傷及纖維化的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　健康雄性SPF級SD大鼠60只（6周齡，體重159.8±11.1g），按體重隨機(jī)分為4組:對照組（自由采食

5、、飲純水）、GSE干預(yù)組（自由采食、飲純水，GSE按100mg/kg體重隔日灌胃）、As暴露組（自由采食，飲30mg/L NaAsO2水溶液）和GSE+As聯(lián)合組。
　　12個月實(shí)驗期后，HE染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變;ELISA測肝功能和炎癥因子;Real Time-PCR測肝纖維化相關(guān)標(biāo)志物;分光光度法測抗氧化水平;化學(xué)熒光法、TBA法和分光光度法分別測活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)、丙二醛、蛋白

6、質(zhì)羰基含量;Western blot測還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase，NOX)主要亞基及pSmad2/3的蛋白表達(dá)。
　　采用大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)，化學(xué)熒光法、NADPH法測不同劑量GSE對As誘導(dǎo)HSC內(nèi)ROS水平和NOX活性的影響;化學(xué)熒光法分別測As誘導(dǎo)二苯基碘(DPI)孵育的HSCs和Nox4 siRNA干擾的HSCs產(chǎn)生ROS的水平;化學(xué)熒光法、NADPH法、Real Tim

7、e-PCR分別測GSE對As誘導(dǎo)Nox4過表達(dá)的HSCs內(nèi)ROS水平、NOX活性及肝纖維化相關(guān)因子的水平;熒光素酶活性檢測GSE對TGF-β/Smad途徑的作用;Real Time-PCR測GSE對TGF-β誘導(dǎo)Smad3過表達(dá)的HSCs內(nèi)纖維化標(biāo)志物的影響。
　　SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和處理。均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）對資料進(jìn)行描述，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗

8、水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.與對照組相比，As暴露組大鼠的體重降低、肝臟系數(shù)增加，血清中ALT、AST、膽紅素水平升高，白蛋白水平降低，促炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、和TNF-α)水平增加，促纖維化因子表達(dá)水平增高（P均＜0.05）。GSE+As聯(lián)合干預(yù)組大鼠的這些指標(biāo)，與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）;而與As暴露組相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。在形態(tài)學(xué)上，As暴露組大鼠

9、肝臟發(fā)生了纖維化改變;
　　2.與對照組相比，As暴露大鼠肝組織中抗氧化物、抗氧化酶水平降低，氧化產(chǎn)物、ROS、臘質(zhì)過氧化產(chǎn)物及蛋白質(zhì)羰基的含量升高(P均＜0.05); GSE+As聯(lián)合干預(yù)組大鼠的這些指標(biāo)，與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0.05);而與As暴露組相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。與對照組相比，As暴露大鼠肝組織NOX的亞基Nox2、Nox4和p47phox的表達(dá)水平升高，磷酸化Smad2/3的

10、水平升高（P均＜0.05）;GSE+As聯(lián)合干預(yù)組大鼠肝組織NOX亞基的水平及磷酸化Smad2/3的水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），與As暴露組相比，明顯降低（P均＜0.05）。
　　4.細(xì)胞實(shí)驗表明，GSE劑量依賴性地抑制砷誘導(dǎo)HSCs內(nèi)ROS水平及NOX活性(P＜0.05);與陰性對照相比，砷可以誘導(dǎo)HSCs產(chǎn)生ROS增加(P＜0.05);而DPI與砷共同孵育細(xì)胞后，ROS的產(chǎn)生受到抑制(P＜0.05);進(jìn)

11、一步應(yīng)用砷刺激沉默Nox4基因的HSCs，發(fā)現(xiàn)ROS的生成量減少(P＜0.05)。同時GSE對As誘導(dǎo)Nox4過表達(dá)HSCs內(nèi)ROS水平、NOX活性及致纖維化因子的表達(dá)有抑制作用（P均＜0.05）。
　　5.GSE劑量依賴性地抑制TGF-β/smad信號通路(P＜0.05);GSE對TGF-β誘導(dǎo)的Smad3過表達(dá)HSCs內(nèi)肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)有抑制作用（P均＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1)慢性砷暴露導(dǎo)致肝臟的炎