陳皮生物堿提取物抗肺纖維化的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 研究陳皮生物堿提取物(Citrusalkaloidextract，CAE)，對人胚肺成纖維細胞(MRC-5)增殖的影響；運用博萊霉素(BLM)誘導的大鼠肺纖維化(PF)模型，研究陳皮生物堿提取物對大鼠PF的干預治療作用，并探討其可能的作用機制。
　　 方法：
　　 1．將MRC-5細胞傳代培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后進行實驗。細胞分為正常對照組、藥物實驗組，采用四氮唑鹽比色法（MTT法）對不同濃度的

2、陳皮生物堿提取物進行實驗，同時采用乳酸脫氫酶(LDH)測定法來檢測陳皮生物堿提取物的細胞毒性。
　　 2．大鼠隨機分為正常組、對照組、強的松組、陳皮生物堿提取物8mg/kg/day（CAE-8）組、16mg/kg/day(CAE-16)組，32mg/kg/day(CAE-32)組。各組大鼠每周稱重，觀察其體重變化；除正常組外，其余各組均采用BLM氣管內(nèi)注入建立PF模型。建模后正常組和對照組大鼠予生理鹽水灌胃，其余各組大鼠分別給予

3、陳皮生物堿提取物溶液灌胃。各組大鼠于實驗第28天處死，留取血清及肺組織。將肺組織行HE及Masson染色觀察肺組織病理學變化，判斷肺泡炎和肺纖維化的程度。采用堿水解法及紫外分光光度檢測法測定大鼠血清和肺組織中羥脯氨酸(HYP)的含量；分別使用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白質(zhì)印記法(Westernblotting)檢測肺組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)

4、的mRNA和蛋白的表達水平，并進行圖像定量分析。
　　 結果：
　　 1．體外實驗：陳皮生物堿提取物在不同濃度下均表現(xiàn)為抑制MRC-5增殖的作用，并隨劑量變化呈量效關系。通過LDH法驗證陳皮生物堿提取物對MRC-5細胞增殖的抑制作用為其藥物活性而非其毒性。
　　 2．體重變化：陳皮生物堿提取物CAE-16組在第7天、第21天、第28天以及CAE-32組在第28天時體重增幅顯著高于對照組(P＜0.01);CAE-8

5、組在第7天時體重增幅明顯高于強的松組(P＜0.01)。
　　 3．肺泡炎及肺纖維化積分：陳皮生物堿提取物處理組（CAE-8，16，32組）肺泡炎及肺纖維化積分均顯著低于對照組(P＜0.01或P＜0.05)。
　　 4．HYP含量測定結果：強的松組、陳皮生物堿提取物處理組（CAE-8，16，32組）肺組織及血清中HYP含量均低于對照組(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 5．RT-PCR及Westernblott

6、ing檢測結果：和正常組比較：對照組大鼠肺組織中MMP-9的mRNA及蛋白表達水平均下降（P＜0.05或P＜0.01），同時，TIMP-1的mRNA及蛋白表達水平均顯著升高(P＜0.05)，對照組肺組織中TNF-αmRNA及蛋白的表達水平均顯著升高(P＜0.05)。(1)各組藥物處理組肺組織中MMP-9mRNA表達水平和對照組比較，CAE-8組和CAE-32組均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，強的松組和CAE-16也有所升高，但

7、無統(tǒng)計學意義；各組藥物處理組肺組織中TIMP-1mRNA表達水平和對照組比較：CAE-32組、強的松組和CAE-16組均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），CAE-8組也有所下降，但無統(tǒng)計學意義；各組藥物處理組肺組織中TNF-αmRNA表達水平和對照組比較：強的松組、CAE-16組及CAE-32組顯著下降(P＜0.05)，CAE-8組也有所下降，但無統(tǒng)計學意義。(2)各組藥物處理組肺組織中MMP-9蛋白表達水平和對照組比較：強的松組

8、、CAE-16組及CAE-32組均顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，CAE-8組也有所升高，但無統(tǒng)計學意義；各組藥物處理組肺組織中TIMP-1蛋白表達水平和對照組比較：強的松組、CAE-8組、CAE-16組和CAE-32組均顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)。各組藥物處理組肺組織中TNF-α蛋白表達水平和對照組比較：CAE-32組顯著下降(P＜0.01)，強的松組、CAE-8及CAE-16均有所下降，但無統(tǒng)計學意義。