血管活性腸肽對(duì)新生大鼠始基卵泡體外發(fā)育影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使許多腫瘤、自身免疫疾病和骨髓移植患者得到了臨床上的治愈，卻面臨卵巢功能的嚴(yán)重?fù)p害；同時(shí)，越來越多的女性由于職業(yè)競爭壓力的增大而一再推遲生育年齡，給優(yōu)生優(yōu)育帶來了隱患。如何充分利用生殖資源保存女性的生育能力，是一個(gè)值得研究的重要課題。 哺乳動(dòng)物卵巢組織含有數(shù)以百萬計(jì)的始基卵泡，組成一個(gè)維持雌性哺乳動(dòng)物—生生殖活動(dòng)的卵泡庫。隨著個(gè)體的生長發(fā)育，始基卵泡離開卵泡靜息池，啟動(dòng)生長，卵母細(xì)胞恢復(fù)并完成減數(shù)分裂，最后排

2、卵；但是在雌性個(gè)體一生的生殖活動(dòng)中能夠成熟排卵的僅為卵泡庫中極小一部分(<1％)，絕大多數(shù)卵泡在不同的發(fā)育階段閉鎖。充分利用這部分卵泡，將數(shù)百萬個(gè)早期卵泡保存起來，在需要的時(shí)候進(jìn)行體外培養(yǎng)、成熟，并生育后代，是無數(shù)科學(xué)家多年的夢(mèng)想。近10多年來，隨著生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展，在人類由不成熟竇卵泡在體外培養(yǎng)成熟并進(jìn)行體外受精的IVM技術(shù)已經(jīng)取得長足進(jìn)步，而有關(guān)啟動(dòng)早期卵泡生長發(fā)育成為竇卵泡的研究仍然沒有取得突破；盡管人們已認(rèn)識(shí)到在始基卵泡的發(fā)育過程

3、中，卵泡內(nèi)外不同細(xì)胞之間通過縫隙連接進(jìn)行著有效溝通及對(duì)話，涉及多種細(xì)胞因子的相互作用，如KIT配體(KL，kit ligand)、抗苗勒氏管激素(AMH，anti—Mullerian hormone)等，然而啟動(dòng)始基卵泡生長發(fā)育的信號(hào)通路尚待闡明。 目前研究顯示，啟動(dòng)始基卵泡生長發(fā)育的過程是不依賴垂體促性腺激素的，而卵巢局部神經(jīng)的功能活動(dòng)早于卵泡生長的啟動(dòng)。神經(jīng)遞質(zhì)血管活性腸肽(vasoactive intestinal pep

4、tide，VIP)在調(diào)控卵泡生長發(fā)育中的作用也引起了學(xué)者們的關(guān)注。作為G蛋白偶聯(lián)受體B家族的成員之一，它的功能作用主要是由高親合力受體VPAC1、VPAC2優(yōu)先結(jié)合Gs蛋白，激活腺苷酸環(huán)化酶活動(dòng)，通過環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)第二信使系統(tǒng)發(fā)揮生物效應(yīng)。相關(guān)研究已經(jīng)觀察到VIP參與排卵前卵泡的若干功能活動(dòng)、誘導(dǎo)FSH受體的形成及芳香酶活性的增強(qiáng)，并調(diào)節(jié)竇前卵泡的生長與竇腔形成；最近

5、的研究發(fā)現(xiàn)，VIP不僅出現(xiàn)在生長卵泡的膜細(xì)胞層、竇前卵泡，在始基卵泡周圍也有表達(dá)，提示其參與早期卵泡生長發(fā)育調(diào)控的可能性，但目前仍缺少神經(jīng)肽VIP參與始基卵泡活化與生長發(fā)育機(jī)制的研究，值得我們對(duì)此進(jìn)行更深入的研究。 基于當(dāng)前對(duì)早期卵泡啟動(dòng)發(fā)育機(jī)制的研究進(jìn)展，我們?cè)O(shè)想神經(jīng)遞質(zhì)VIP可能參與了啟動(dòng)始基卵泡生長發(fā)育調(diào)控：本實(shí)驗(yàn)采用新生大鼠卵巢體外培養(yǎng)的方法，通過添加VIP、KL，觀察VIP對(duì)始基卵泡的啟動(dòng)是否有作用。 材料與方

6、法: 1.動(dòng)物來源：雌性SD大鼠購自中山大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。清潔級(jí)，出生4天，體重10-15g。 2.實(shí)驗(yàn)方法：在解剖顯微鏡下完整分離大鼠雙側(cè)卵巢，隨機(jī)分配到各處理組；新鮮對(duì)照組直接固定、包埋、切片、染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；基礎(chǔ)培養(yǎng)組以無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，VIP組、KL組分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加VIP、KL，各培養(yǎng)組均在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天；培養(yǎng)結(jié)束后卵巢經(jīng)固定、包埋、切片，進(jìn)行組織病理學(xué)分析、PC

7、NA免疫組化染色，熒光定量PCR檢測KLmRNA的表達(dá)，ELISA檢測培養(yǎng)基中甾體激素水平。觀察神經(jīng)肽VIP對(duì)早期卵泡的啟動(dòng)及生長發(fā)育的影響并探討其作用機(jī)制。 結(jié)果: 1.完整卵巢體外培養(yǎng)對(duì)早期卵泡體外發(fā)育的影響 新生4天大鼠卵巢在培養(yǎng)過程中，外觀未見異常。培養(yǎng)結(jié)束后組織病理學(xué)觀察顯示，切片上仍有大量健康卵泡存活。在通過卵巢中心的最大徑線切片上計(jì)數(shù)健康卵泡總數(shù)，在此基礎(chǔ)上，于200×光鏡下，進(jìn)行各級(jí)卵泡分類計(jì)數(shù)，

8、在新鮮大鼠卵巢切片上，始基卵泡(0級(jí))在全部卵泡所占比例為66.87±7.45％，早初級(jí)卵泡(1級(jí))占25.51±6.01％，初級(jí)卵泡(2級(jí))占3.43±1.87％，而轉(zhuǎn)化卵泡及竇前卵泡(3-4級(jí))占4.17±1.36％；絕大部分未啟動(dòng)發(fā)育的始基卵泡主要分布在卵巢表面的皮質(zhì)區(qū)，而較大的轉(zhuǎn)化卵泡及竇前卵泡位于皮質(zhì)深部，靠近卵巢中心部分的髓質(zhì)區(qū)，所有新生4天新鮮大鼠卵巢切片中未觀察到竇卵泡。 與新鮮大鼠卵巢不同的是，在無血清培養(yǎng)液中

9、體外培養(yǎng)14天后的卵巢切片中，可觀察到的健康卵泡總數(shù)：基礎(chǔ)培養(yǎng)組141±23.25個(gè)/片，VIP組116±36.57個(gè)/片，KL組為143±40.62個(gè)/片，與新鮮未培養(yǎng)組(139±32.32個(gè)/片)之間未出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。進(jìn)一步進(jìn)行分級(jí)卵泡分析顯示，新鮮卵巢組始基卵泡比例為66.87±7.45％，與之相比較，基礎(chǔ)培養(yǎng)組卵巢中始基卵泡比例明顯減少至54.75±10.97％，伴隨早初級(jí)卵泡比例較的明顯升高(54.31±8.52％ V

10、S36.85±11.01％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；初級(jí)卵泡、轉(zhuǎn)化卵泡及竇前卵泡的比例與新鮮卵巢相比較未顯示出有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。 2.VIP對(duì)始基卵泡啟動(dòng)生長發(fā)育的影響 在卵巢基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別添加VIP(10-7M)、KL(50ng/ml)，以無額外添加的基礎(chǔ)培養(yǎng)組為陰性對(duì)照，完全相同條件下培養(yǎng)14天后組織病理學(xué)觀察顯示：與基礎(chǔ)培養(yǎng)組相比較，VIP組、KL組切片上卵巢表面皮質(zhì)區(qū)的始基卵泡明顯減少，同時(shí)該區(qū)域的生長卵泡增加；

11、經(jīng)分級(jí)卵泡計(jì)數(shù)，KL組平均每張切片上始基卵泡比例為34.02±5.44％，VIP組始基卵泡比例下降到36.82±4.69％，伴隨著生長卵泡比例的上升(KL組65.97±5.44％、VIP組63.17±4.69％)，各組間靜息/生長卵泡比例經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示：與基礎(chǔ)培養(yǎng)組相比較，VIP、KL組始基卵泡比例降低、生長卵泡比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步的生長卵泡分類分析顯示，早初級(jí)卵泡比例的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01。與KL組不同的是，在

12、VIP組還觀察到接近皮質(zhì)表面轉(zhuǎn)化卵泡生成，3-4級(jí)(轉(zhuǎn)化卵泡及竇前卵泡)比例升高，5.25±3.06％ VS3.48±1.27％，但差異未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p=0.151。 3.PCNA免疫組織化學(xué)染色評(píng)價(jià)卵泡生長 未經(jīng)培養(yǎng)的新鮮卵巢切片中，始基卵泡基本不著色，但觀察發(fā)現(xiàn)有個(gè)別始基卵泡的卵母細(xì)胞著色；從早初級(jí)卵泡開始，生長卵泡中的顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)PCNA陽性著色，在各級(jí)卵泡中，初級(jí)卵泡才開始出現(xiàn)明顯的卵母細(xì)胞著色。陰性對(duì)照組

13、未觀察到陽性著色。與新鮮對(duì)照組相似，基礎(chǔ)培養(yǎng)組、VIP組培養(yǎng)14天后進(jìn)行免疫組化染色后顯示早初級(jí)卵泡已出現(xiàn)PCNA著色，主要在卵母細(xì)胞，雖然在扁平梭形的前顆粒尚未見著色，但卵母細(xì)胞周圍的柱狀顆粒細(xì)胞開始顯示陽性，其他各級(jí)生長卵泡的卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞均顯示陽性。與健康正常的各級(jí)生長卵泡的強(qiáng)PCNA著色不同，在閉鎖卵泡，卵母細(xì)胞的PCNA著色減弱，同時(shí)，顆粒細(xì)胞的著色開始減少、缺失非常顯著。在新鮮未培養(yǎng)組，只有34.17±5.02％的卵泡中

14、至少有一個(gè)顆粒細(xì)胞顯示PCNA陽性；經(jīng)14天體外培養(yǎng)后，基礎(chǔ)培養(yǎng)組、VIP組中分別有30.78±8.07％、48.53±5.45％的卵泡中出現(xiàn)著色顆粒細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)分析顯示，新鮮組與基礎(chǔ)培養(yǎng)組之間PCNA陽性卵泡比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p=0.484；而VIP組PCNA陽性卵泡比例高于新鮮組及基礎(chǔ)培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.001。 4.VIP對(duì)KL mRNA表達(dá)的影響 新生4天大鼠18只，按配對(duì)設(shè)計(jì)，用實(shí)時(shí)定量RT—P

15、CR分析不同培養(yǎng)條件下卵巢KL mRNA表達(dá)量，在VIP培養(yǎng)組較對(duì)照組升高，1.73+1.042 VS0.76±0.46，經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，p=0.039，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.VIP對(duì)雌激素、雄烯二酮分泌水平的影響 組織培養(yǎng)過程中，每隔1天更換一次培養(yǎng)液，收集并低溫保存，培養(yǎng)結(jié)束后，將VIP組、基礎(chǔ)培養(yǎng)組收集的培養(yǎng)液每二孔合并成一個(gè)測量單位，應(yīng)用ELISA檢測雄烯二酮、雌二醇水平。培養(yǎng)液中可檢測到雌二醇、雄烯二酮的分