牛卵巢組織竇前卵泡的凍存方法及不同培養(yǎng)體系對始基卵泡活性的影響.pdf

1、隨著癌癥早期診療水平的提高以及放化療技術(shù)的進(jìn)步，年輕女性癌癥患者的生存率顯著增加。但放化療可能造成女性生育能力的下降甚至喪失，故在放化療前保存生育能力的問題變得尤為重要。卵巢組織冷凍保存并移植已經(jīng)被認(rèn)為是保存生育能力的有效方法，然而有研究表明移植凍融的卵巢組織有可能將原腫瘤灶重新移入體內(nèi)，因此體外培養(yǎng)或移植竇前卵泡可能是更安全的選擇，然而在卵巢組織冷凍復(fù)蘇后，分離出竇前卵泡前需確定冷凍對竇前卵泡活性的影響，以及選擇有活性的竇前卵泡進(jìn)行移

2、植或體外培養(yǎng)。始基卵泡是卵巢組織內(nèi)最豐富的卵泡，其僅有一小部分通過卵泡發(fā)育途徑被激活，而大部分都閉鎖，當(dāng)始基卵泡池內(nèi)始基卵泡的個數(shù)少于1000個時，絕經(jīng)將隨之而來，因此始基卵泡是女性生育能力保存的關(guān)鍵，因此，若能在體外成功的培養(yǎng)始基卵泡，對女性生育能力的保存有著重大的意義。目前國內(nèi)外有多項研究致力于比較程序化冷凍法和玻璃化冷凍法冷凍卵巢組織的效果,但所得結(jié)果尚無定論。此外，目前國內(nèi)尚無研究報道體外培養(yǎng)始基卵泡的最佳條件。本研究第一部分探

3、討兩種冷凍方法對卵巢組織內(nèi)竇前卵泡的活性影響，從而為體外培養(yǎng)以及移植竇前卵泡奠定基礎(chǔ)。第二部分在體外用二維培養(yǎng)體系和藻酸鈉凝膠三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)凍融后單個始基卵泡，探討始基卵泡在體外培養(yǎng)所需的最適的生長環(huán)境。
　　目的
　　探討玻璃化冷凍法和程序化冷凍法對牛卵巢組織內(nèi)竇前卵泡活性的影響，以及體外三維培養(yǎng)凍融的始基卵泡的最適藻酸鹽濃度。
　　材料與方法
　　1、實驗材料：取新鮮的牛卵巢組織，將卵巢組織皮質(zhì)剪成大小約為

4、0.5㎝×0.8㎝×0.3㎝的組織塊。
　　2、實驗方法：①將卵巢皮質(zhì)片隨機分為新鮮對照組、程序化冷凍組、玻璃化冷凍組，每組各10片，后兩組分別應(yīng)用其相應(yīng)的方法冷凍卵巢組織并復(fù)蘇，三組均隨機挑出3-4片卵巢組織用4％多聚甲醛固定，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析。將三組余卵巢組織分別剪碎，加入Liberase DH酶消化，消化終止后隨機挑取竇前卵泡，并記數(shù)，然后進(jìn)行熒光染色，鑒定卵泡的活性。②玻璃化冷凍卵巢組織，解凍后分離出始基卵泡，將其置于二

5、維培養(yǎng)系統(tǒng)(對照組)和濃度分別為0.5%，1%，2%藻酸鈉凝膠中培養(yǎng)8天，每隔一天在顯微鏡下觀察卵泡的生長情況，測量卵泡的直徑并半量換液，將收集的培養(yǎng)液保存于-20℃的冰箱，并采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECLIA)測定卵泡分泌的雌二醇(E2)的水平，并在培養(yǎng)8d后進(jìn)行熒光染色，鑒定卵泡的活性。
　　3、統(tǒng)計學(xué)方法：用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料采用卡方檢驗其他實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)表示，采用單因素方差分

6、析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1、三組用組織學(xué)分析和用酶解法分離出的單個卵泡的結(jié)果均顯示，卵巢組織內(nèi)不同類型的竇前卵泡的數(shù)量分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其中以始基卵泡為主，其次為初級卵泡，次級卵泡所占比例最少，未見竇狀卵泡。
　　2、熒光染色后，程序化冷凍組和玻璃化冷凍組的竇前卵泡中未受損的卵泡（V1）低于新鮮對照組，輕微受損卵泡和中度受損卵泡（V2＋V3）及死亡卵泡（V4）均高于新鮮

7、對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩冷凍組中的未受損的卵泡（V1）數(shù)量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、熒光染色后，在未受損的卵泡中，三組始基卵泡的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，程序化冷凍組初級卵泡低于新鮮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而玻璃化冷凍組的初級卵泡較新鮮組無統(tǒng)計學(xué)差異，由于分離出次級卵泡所占比例低，故未行統(tǒng)計學(xué)分析，玻璃化冷凍與程序化冷凍組中未受損的初級卵泡相比，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P

8、＞0.05）。
　　4、體外培養(yǎng)始基卵泡8d后，發(fā)現(xiàn)卵泡在二維培養(yǎng)環(huán)境中難以存活，藻酸鈉三維培養(yǎng)系統(tǒng)更適合體外培養(yǎng)始基卵泡。
　　5、在濃度為0.5%，1%，2%的藻酸鹽凝膠分別培養(yǎng)始基卵泡8天后發(fā)現(xiàn)，卵泡的直徑均有不同程度的增加，其中在2%的藻酸鈉凝膠組中直徑增加最多（P＜0.05），熒光染色后，2%的藻酸鈉凝膠組的未受損卵泡率較其他兩組高，與0.5%藻酸鈉凝膠組相比，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05），而與1%藻酸鈉凝膠組相

9、比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。檢測三組濃度不同的藻酸鈉凝膠組中E2的水平發(fā)現(xiàn)，E2隨著培養(yǎng)時間的延長分泌增多，同時也符合各組卵泡的增長趨勢，2%的藻酸鈉凝膠組中分泌的最多，與0.5%藻酸鈉組比，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05），而與濃度為1%的藻酸鈉組相比，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　1、冷凍解凍過程對卵巢組織有一定的損傷，一部分初級卵泡和次級卵泡受損，但是對始基卵泡的活性影響較小。
　　2、玻璃化冷凍法和程序化冷凍法均能