激活素A和卵泡抑素對凍融人胎兒卵巢原始卵泡體外發(fā)育影響的實驗研究.pdf

1、目的：醫(yī)學技術的進步使許多年輕癌癥患者的生存率得到顯著提高，但癌癥治療的放化療過程可能導致女性患者面臨卵巢功能衰竭、生育力喪失的危險。目前而言，凍存卵巢皮質是最有效的卵子庫技術，而如何利用冷凍保存的卵巢皮質的原始卵泡，恢復其內分泌和生殖功能是國際醫(yī)學界的研究熱點。卵泡體外培養(yǎng)作為一項新興技術引起廣泛關注。雖然哺乳動物原始卵泡體外生長和成熟的能力已得到證實[1]。但人類卵泡體外成熟的研究尚處于早期階段，迫切需要大量的實驗研究促進該方法的實

2、質性突破和成熟。激活素A(Activin-AAA)是轉化生長因子(transforminggrowthfactor，TGF)-β超家族成員，具有廣泛的生理作用，其作用可被卵泡抑素(Follistatin，F(xiàn)S)所拮抗。FS是Act的結合蛋白，可調節(jié)Act的多種生化活性。AA和FS在卵泡生長發(fā)育中重要的局部調節(jié)作用也越來越受到關注，但其對原始卵泡激活的作用尚無相關報道。本實驗通過凍融人胎兒卵巢皮質片的體外培養(yǎng)技術，應用光鏡、免疫組織化學染

3、色及RT-PCR等實驗技術檢測AA和FS對凍融人胎兒卵巢組織原始卵泡體外發(fā)育的影響，分析其對卵泡基礎雌激素分泌的作用，旨在試圖建立適宜的培養(yǎng)體系，有效促進人卵巢組織卵泡體外發(fā)育和成熟，為凍融人卵巢組織的臨床應用和人卵巢庫的建立提供實驗依據(jù)。 方法： 取中期引產胎兒卵巢皮質塊經過慢凍、速融后于3712，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天半量換液。分別收集各培養(yǎng)組2天、4天、6天、8天更換的培養(yǎng)液到EP管中于-20℃保存，用于測定雌

4、二醇(E2)含量；培養(yǎng)第8天回收培養(yǎng)物?；A培養(yǎng)液為α-MFM(α-MinimumEssentialMedium，GIBCO公司)，含5％胎牛血清、100U/mL的卵泡刺激素(FSH)、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素、1/100ITS(胰島素-轉鐵蛋白-硒，insulin-transferrin-selenium)，根據(jù)實驗條件分別添加100ng/mlAA和/或100ng/mlFS。實驗分組為新鮮組、凍融組、MEM組(α

5、-MEM)即培養(yǎng)對照組、AA組(α-MEM+AA)、FS組(α-MEM+FS)和A+F組(α-MEM+AA+FS)。采用免疫發(fā)光法測定各組培養(yǎng)液E2值，通過常規(guī)石蠟切片光鏡觀察胎兒卵巢組織凍融前后和培養(yǎng)前后的組織學變化，免疫組化方法觀察細胞增殖及卵泡凋亡情況、AA和FS的蛋白定位和表達，RT-PCR.半定量測定AA和FSmRNA的表達。 結果： 一、人胎兒卵巢組織凍融前后的檢測 1、光學顯微鏡觀察 新鮮組

6、和凍融組均以原始卵泡為主。兩組比較，凍融組正常原始卵泡數(shù)有所減少(33.67±6.62vs30.80±2.39)，而異常卵泡數(shù)有所增多(0.13±0.35vs0.47±0.64)，但差異均無顯著性(P＞0.05)。 新鮮組和凍融組卵泡和卵母細胞直徑分別為(40.07±3.40vs40.82±4.28，32.26±3.28vs31.65±2.53)，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義。 2、凋亡的檢測 新鮮組和凍融組分別觀察

7、原始卵泡283和237個，凋亡卵泡數(shù)分別為5和9個，凋亡率分別為1.77％和3.80％。凋亡大多發(fā)生在卵母細胞，偶爾見顆粒細胞的凋亡。 3、PCNA的檢測： 新鮮組和凍融組中分別觀察原始卵泡165和146個，均未見有PCNA的陽性表達。 4、從、FS蛋白和mRNA的表達 AA、Fs在胎兒卵巢組織中卵母細胞胞漿中強表達，在顆粒細胞的表達較弱；新鮮組和凍融組的MOD值比較(AA:0.302±0.113vs0.

8、295±0.017，F(xiàn)S:0.363±0.016vs0.384±0.020)，mRNA表達量分別為(AA:1.05±0.97vs0.98±0.03，F(xiàn)S:1.05±0.03vs1.02±0.18)，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 二、人胎兒卵巢組織體外培養(yǎng)后的檢測 1、光學顯微鏡觀察 培養(yǎng)后各組中均以初級卵泡為主，與未培養(yǎng)組(新鮮組和凍融組)相比，原始卵泡明顯減少，P＜0.01。未見次級及以上級別卵泡。對照

9、組、AA組、FS組、A±F組初級卵泡比例分別為(78.46％、86.95％、80.85％、83.87％)，可見AA組明顯高于對照組，差異顯著。培養(yǎng)8d后異常卵泡明顯增多(9.07±1.67、5.27±1.28、11.53±2.45、8.13±2.62)，與未培養(yǎng)組差異非常顯著。培養(yǎng)組之間也有差異，AA組明顯少于其他各組(P＜0.05)。 各培養(yǎng)組卵泡和卵母細胞直徑均有增大(43.62±3.17、50.02±3.58、43.91±

10、3.34、47.29±3.20；33.86±4.23、37.73±4.50、34.17±3.74、33.58±3.74)。與未培養(yǎng)組(新鮮組和凍融組)比較，差異非常顯著(P＜0.01)。與對照組相比，AA組、A+F組卵泡直徑，AA組卵母細胞直徑增大具統(tǒng)計學意義。 2、凋亡的檢測 培養(yǎng)后大部分形態(tài)正常的卵泡表現(xiàn)為TUNEL陰性。僅有5.0％(19/383)的正常卵泡的卵母細胞和/或顆粒細胞呈凋亡陽性表達。四組卵巢間質中也可

11、見細胞的凋亡。 3、PCNA的檢測： 少數(shù)原始卵泡中可偶見體積增大的立方形顆粒細胞PCNA的陽性表達。初級卵泡為顆粒細胞和/或卵母細胞的PCNA陽性表達。四組卵巢間質都有PCNA的大量表達。 4、AA、FS蛋白和mRNA的表達 培養(yǎng)后AA、Fs表達均減弱，與未培養(yǎng)組(新鮮組和凍融組)比較，差異非常顯著(P＜0.01)。各培養(yǎng)組間無明顯差異。PCR結果與免疫組化結果相符合。 5、雌二醇(E2)分泌量

12、的測定 各培養(yǎng)組的卵巢組織，培養(yǎng)4天、6天、8天分泌的E2值均高于2天值，差異有顯著性(P＜0.05)；但總體呈先增加后減少的雙向變化，在6天達較高分泌水平；同一時間段的AA.組E2分泌量明顯高于對照組、FS組和A+F組，差異有顯著性(P＜0.01)。 結論： 1、與新鮮組比較，凍融人胎兒卵巢組織，組織學觀察顯示原始卵泡形態(tài)結構保存良好，卵泡數(shù)量無明顯減少；在體外培養(yǎng)條件下，原始卵泡能存活并繼續(xù)生長發(fā)育進入較高級

13、階段；E2的分泌、增殖細胞抗原(PCNA)及凋亡的檢測證實了組織處于良好的生長狀態(tài)。表明凍融胎兒卵巢組織中原始卵泡能保持形態(tài)和功能的完整，慢速冷凍法適合人胎兒卵巢組織的保存，凍融胎兒卵巢組織能在體外進一步生長發(fā)育。 2、AA促進卵巢組織內原始卵泡的體外存活和生長，更好的維持卵泡形態(tài)，促進雌激素的分泌，說明AA在卵巢組織的體外發(fā)育過程中起著重要的調節(jié)作用。 3、AA組正常卵泡比例、卵母細胞直徑、E2分泌量較對照組顯著增高，