激活素A和卵泡抑素對(duì)凍融人胎兒卵巢原始卵泡體外發(fā)育影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步使許多年輕癌癥患者的生存率得到顯著提高，但癌癥治療的放化療過(guò)程可能導(dǎo)致女性患者面臨卵巢功能衰竭、生育力喪失的危險(xiǎn)。目前而言，凍存卵巢皮質(zhì)是最有效的卵子庫(kù)技術(shù)，而如何利用冷凍保存的卵巢皮質(zhì)的原始卵泡，恢復(fù)其內(nèi)分泌和生殖功能是國(guó)際醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。卵泡體外培養(yǎng)作為一項(xiàng)新興技術(shù)引起廣泛關(guān)注。雖然哺乳動(dòng)物原始卵泡體外生長(zhǎng)和成熟的能力已得到證實(shí)[1]。但人類(lèi)卵泡體外成熟的研究尚處于早期階段，迫切需要大量的實(shí)驗(yàn)研究促進(jìn)該方法的實(shí)

2、質(zhì)性突破和成熟。激活素A(Activin-AAA)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor，TGF)-β超家族成員，具有廣泛的生理作用，其作用可被卵泡抑素(Follistatin，F(xiàn)S)所拮抗。FS是Act的結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)Act的多種生化活性。AA和FS在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育中重要的局部調(diào)節(jié)作用也越來(lái)越受到關(guān)注，但其對(duì)原始卵泡激活的作用尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)凍融人胎兒卵巢皮質(zhì)片的體外培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)用光鏡、免疫組織化學(xué)染

3、色及RT-PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)AA和FS對(duì)凍融人胎兒卵巢組織原始卵泡體外發(fā)育的影響，分析其對(duì)卵泡基礎(chǔ)雌激素分泌的作用，旨在試圖建立適宜的培養(yǎng)體系，有效促進(jìn)人卵巢組織卵泡體外發(fā)育和成熟，為凍融人卵巢組織的臨床應(yīng)用和人卵巢庫(kù)的建立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 取中期引產(chǎn)胎兒卵巢皮質(zhì)塊經(jīng)過(guò)慢凍、速融后于3712，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天半量換液。分別收集各培養(yǎng)組2天、4天、6天、8天更換的培養(yǎng)液到EP管中于-20℃保存，用于測(cè)定雌

4、二醇(E2)含量；培養(yǎng)第8天回收培養(yǎng)物?；A(chǔ)培養(yǎng)液為α-MFM(α-MinimumEssentialMedium，GIBCO公司)，含5％胎牛血清、100U/mL的卵泡刺激素(FSH)、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素、1/100ITS(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒，insulin-transferrin-selenium)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件分別添加100ng/mlAA和/或100ng/mlFS。實(shí)驗(yàn)分組為新鮮組、凍融組、MEM組(α

5、-MEM)即培養(yǎng)對(duì)照組、AA組(α-MEM+AA)、FS組(α-MEM+FS)和A+F組(α-MEM+AA+FS)。采用免疫發(fā)光法測(cè)定各組培養(yǎng)液E2值，通過(guò)常規(guī)石蠟切片光鏡觀察胎兒卵巢組織凍融前后和培養(yǎng)前后的組織學(xué)變化，免疫組化方法觀察細(xì)胞增殖及卵泡凋亡情況、AA和FS的蛋白定位和表達(dá)，RT-PCR.半定量測(cè)定AA和FSmRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 一、人胎兒卵巢組織凍融前后的檢測(cè) 1、光學(xué)顯微鏡觀察 新鮮組

6、和凍融組均以原始卵泡為主。兩組比較，凍融組正常原始卵泡數(shù)有所減少(33.67±6.62vs30.80±2.39)，而異常卵泡數(shù)有所增多(0.13±0.35vs0.47±0.64)，但差異均無(wú)顯著性(P＞0.05)。 新鮮組和凍融組卵泡和卵母細(xì)胞直徑分別為(40.07±3.40vs40.82±4.28，32.26±3.28vs31.65±2.53)，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、凋亡的檢測(cè) 新鮮組和凍融組分別觀察

7、原始卵泡283和237個(gè)，凋亡卵泡數(shù)分別為5和9個(gè)，凋亡率分別為1.77％和3.80％。凋亡大多發(fā)生在卵母細(xì)胞，偶爾見(jiàn)顆粒細(xì)胞的凋亡。 3、PCNA的檢測(cè)： 新鮮組和凍融組中分別觀察原始卵泡165和146個(gè)，均未見(jiàn)有PCNA的陽(yáng)性表達(dá)。 4、從、FS蛋白和mRNA的表達(dá) AA、Fs在胎兒卵巢組織中卵母細(xì)胞胞漿中強(qiáng)表達(dá)，在顆粒細(xì)胞的表達(dá)較弱；新鮮組和凍融組的MOD值比較(AA:0.302±0.113vs0.

8、295±0.017，F(xiàn)S:0.363±0.016vs0.384±0.020)，mRNA表達(dá)量分別為(AA:1.05±0.97vs0.98±0.03，F(xiàn)S:1.05±0.03vs1.02±0.18)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 二、人胎兒卵巢組織體外培養(yǎng)后的檢測(cè) 1、光學(xué)顯微鏡觀察 培養(yǎng)后各組中均以初級(jí)卵泡為主，與未培養(yǎng)組(新鮮組和凍融組)相比，原始卵泡明顯減少，P＜0.01。未見(jiàn)次級(jí)及以上級(jí)別卵泡。對(duì)照

9、組、AA組、FS組、A±F組初級(jí)卵泡比例分別為(78.46％、86.95％、80.85％、83.87％)，可見(jiàn)AA組明顯高于對(duì)照組，差異顯著。培養(yǎng)8d后異常卵泡明顯增多(9.07±1.67、5.27±1.28、11.53±2.45、8.13±2.62)，與未培養(yǎng)組差異非常顯著。培養(yǎng)組之間也有差異，AA組明顯少于其他各組(P＜0.05)。 各培養(yǎng)組卵泡和卵母細(xì)胞直徑均有增大(43.62±3.17、50.02±3.58、43.91±

10、3.34、47.29±3.20；33.86±4.23、37.73±4.50、34.17±3.74、33.58±3.74)。與未培養(yǎng)組(新鮮組和凍融組)比較，差異非常顯著(P＜0.01)。與對(duì)照組相比，AA組、A+F組卵泡直徑，AA組卵母細(xì)胞直徑增大具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、凋亡的檢測(cè) 培養(yǎng)后大部分形態(tài)正常的卵泡表現(xiàn)為T(mén)UNEL陰性。僅有5.0％(19/383)的正常卵泡的卵母細(xì)胞和/或顆粒細(xì)胞呈凋亡陽(yáng)性表達(dá)。四組卵巢間質(zhì)中也可

11、見(jiàn)細(xì)胞的凋亡。 3、PCNA的檢測(cè)： 少數(shù)原始卵泡中可偶見(jiàn)體積增大的立方形顆粒細(xì)胞PCNA的陽(yáng)性表達(dá)。初級(jí)卵泡為顆粒細(xì)胞和/或卵母細(xì)胞的PCNA陽(yáng)性表達(dá)。四組卵巢間質(zhì)都有PCNA的大量表達(dá)。 4、AA、FS蛋白和mRNA的表達(dá) 培養(yǎng)后AA、Fs表達(dá)均減弱，與未培養(yǎng)組(新鮮組和凍融組)比較，差異非常顯著(P＜0.01)。各培養(yǎng)組間無(wú)明顯差異。PCR結(jié)果與免疫組化結(jié)果相符合。 5、雌二醇(E2)分泌量

12、的測(cè)定 各培養(yǎng)組的卵巢組織，培養(yǎng)4天、6天、8天分泌的E2值均高于2天值，差異有顯著性(P＜0.05)；但總體呈先增加后減少的雙向變化，在6天達(dá)較高分泌水平；同一時(shí)間段的AA.組E2分泌量明顯高于對(duì)照組、FS組和A+F組，差異有顯著性(P＜0.01)。 結(jié)論： 1、與新鮮組比較，凍融人胎兒卵巢組織，組織學(xué)觀察顯示原始卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好，卵泡數(shù)量無(wú)明顯減少；在體外培養(yǎng)條件下，原始卵泡能存活并繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)入較高級(jí)

13、階段；E2的分泌、增殖細(xì)胞抗原(PCNA)及凋亡的檢測(cè)證實(shí)了組織處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。表明凍融胎兒卵巢組織中原始卵泡能保持形態(tài)和功能的完整，慢速冷凍法適合人胎兒卵巢組織的保存，凍融胎兒卵巢組織能在體外進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育。 2、AA促進(jìn)卵巢組織內(nèi)原始卵泡的體外存活和生長(zhǎng)，更好的維持卵泡形態(tài)，促進(jìn)雌激素的分泌，說(shuō)明AA在卵巢組織的體外發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。 3、AA組正常卵泡比例、卵母細(xì)胞直徑、E2分泌量較對(duì)照組顯著增高，