利用原始卵泡體外重構(gòu)模型對(duì)小鼠原始卵泡形成機(jī)制的研究.pdf

1、原始卵泡的形成涉及復(fù)雜的生殖細(xì)胞-體細(xì)胞互作，本實(shí)驗(yàn)利用原始卵泡重構(gòu)模型，研究了決定小鼠原始卵泡形成的重要因素及其作用的調(diào)控機(jī)制，結(jié)果表明： 經(jīng)酶解離的小鼠胚胎卵巢細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)可以重構(gòu)形成原始卵泡。通過組織學(xué)及基因表達(dá)的分析，可以確定體外重構(gòu)形成的原始卵泡具有典型的原始卵泡結(jié)構(gòu)。正常的原始卵泡相關(guān)基因(Zp1-3，F(xiàn)iga，Cx43)的表達(dá)以及正常的原始卵泡發(fā)育能力，原始卵泡啟動(dòng)發(fā)育所必須的調(diào)控因子Gdf9，Bmp15和Fsh

2、r基因的表達(dá)都可以在體外培養(yǎng)的重構(gòu)卵泡中檢測(cè)到。 從13.5dpc起，胎鼠卵巢細(xì)胞開始具有體外重構(gòu)形成原始卵泡的能力。12.5dpc胎鼠卵巢的生殖細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)中發(fā)育為卵母細(xì)胞，但不能與此時(shí)的卵巢體細(xì)胞互作形成原始卵泡。通過對(duì)比原始卵泡相關(guān)基因在體外培養(yǎng)的13.5dpc和12.5dpc胎鼠卵巢細(xì)胞中的差異表達(dá)，得出Zp基因的正常表達(dá)決定卵母細(xì)胞在發(fā)育早期的分化，F(xiàn)iga基因的持續(xù)表達(dá)是決定原始卵泡能夠在體外重構(gòu)的必須因素。

3、 利用上述胎鼠生殖細(xì)胞與體細(xì)胞之間細(xì)胞聯(lián)系的分離和重構(gòu)模型，我們隨后研究了在體外重構(gòu)形成轉(zhuǎn)基因卵泡的可能性。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究基因功能的強(qiáng)有力的手段。然而對(duì)于卵母細(xì)胞而言，細(xì)胞分裂的特殊性和卵泡結(jié)構(gòu)決定了到目前為止仍不能夠?qū)⑼庠椿驅(qū)氚l(fā)育中的卵母細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了將外源基因?qū)胩ナ舐殉采臣?xì)胞的方法及可行性。選擇從11.5dpc到15.5dpc，處于不同細(xì)胞分裂狀態(tài)的胎鼠卵巢生殖細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，通常的傳染方法：

4、磷酸鈣法和脂質(zhì)體法均可以用于胎鼠卵巢生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體法擁有較高的轉(zhuǎn)染效率并且對(duì)細(xì)胞沒有明顯的傷害，但是在適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染液孵育時(shí)間內(nèi)(3h)，雖然磷酸鈣方法的轉(zhuǎn)染效率較低，但其對(duì)細(xì)胞后續(xù)的發(fā)育能力保護(hù)更好一些。從13.5dpc起，當(dāng)胎鼠卵巢生殖細(xì)胞開始進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)，全部的胎鼠卵巢生殖細(xì)胞便失去整合外源基因的能力。在15.5dpc之前，尤其是在11.5～13.5dpc，外源基因在胎鼠卵巢生殖細(xì)胞中可表達(dá)，為在卵子發(fā)生早期階段進(jìn)行基因功能

5、的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)手段。 基于原始卵泡體外重構(gòu)模型和卵原細(xì)胞轉(zhuǎn)基因方法，我們進(jìn)一步研究了在體外原始卵泡形成的過程中，生殖細(xì)胞與體細(xì)胞互作的機(jī)制。利用一系列的胎鼠卵巢細(xì)胞共培養(yǎng)，以及“互換、互作卵泡重構(gòu)”實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，原始卵泡形成的過程要求高度同步發(fā)育的生殖細(xì)胞—體細(xì)胞互作。同樣具備卵泡重構(gòu)能力的、不同胎齡的胎鼠卵巢生殖細(xì)胞和體細(xì)胞在體外互換、互作之后，正常的原始卵泡形成過程不能完成。在培養(yǎng)過程中，生殖細(xì)胞Figa基因的表達(dá)逐

6、漸缺失，原始卵泡形成過程不能正常地進(jìn)行，伴隨著Bax基因的異常表達(dá)，生殖細(xì)胞將發(fā)生退化死亡。 原始卵泡形成時(shí)生殖細(xì)胞將發(fā)生大量的凋亡而體細(xì)胞則處于細(xì)胞分裂的抑制狀態(tài)。因此，基于上述胎鼠卵巢中細(xì)胞數(shù)量控制的現(xiàn)象可能對(duì)原始卵泡庫建立時(shí)卵泡的數(shù)量起調(diào)控作用的猜測(cè)，在本實(shí)驗(yàn)中，利用原始卵泡重構(gòu)模型，我們研究了生殖細(xì)胞與體細(xì)胞的數(shù)量對(duì)重構(gòu)形成原始卵泡數(shù)量的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加生殖細(xì)胞或體細(xì)胞的數(shù)量，并不會(huì)促進(jìn)重構(gòu)原始卵泡數(shù)量的增加，相反會(huì)

7、導(dǎo)致體細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖生長(zhǎng)，生殖細(xì)胞不能最終分化為健康的卵母細(xì)胞，進(jìn)而最終導(dǎo)致正常的原始卵泡形成過程不能發(fā)生。由此可見，原始卵泡的形成過程存在精確控制的生殖細(xì)胞—體細(xì)胞數(shù)量的平衡，該平衡的破壞可導(dǎo)致原始卵泡形成的失敗。 由于前人和我們現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)Figa基因是形成原始卵泡的必須因素，于是通過原位雜交技術(shù)及Tunel凋亡檢測(cè)，我們研究了Figa基因在1dpp小鼠卵巢中的表達(dá)及其與原始卵泡形成時(shí)生殖細(xì)胞的選擇和生殖細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

8、研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)iga基因在1dpp小鼠卵巢中的表達(dá)存在生殖細(xì)胞間的差異，即同時(shí)存在Figa基因表達(dá)的陽性和陰性生殖細(xì)胞，這種Figa基因在生殖細(xì)胞間的差異表達(dá)在原始卵泡形成前的17.5dpc胎鼠卵巢中即可以檢測(cè)到。Figa基因在1dpp小鼠卵巢生殖細(xì)胞間的差異表達(dá)可能與原始卵泡形成時(shí)卵母細(xì)胞的選擇有關(guān)。同時(shí)，由于凋亡的生殖細(xì)胞中也可以檢測(cè)Figa基因的表達(dá)，因此Figa基因在1dpp小鼠卵巢中的差異表達(dá)可能并不決定此時(shí)卵巢中的生殖細(xì)胞凋亡

9、。 中腎組織對(duì)胚胎卵巢分化和發(fā)育的作用目前尚未明確，而12.5dpc是胎鼠卵巢分化的關(guān)鍵時(shí)期。因此在本實(shí)驗(yàn)中我們研究了12.5dpc的中腎組織對(duì)此時(shí)的胎鼠卵巢細(xì)胞體外分化發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中腎細(xì)胞并不能促進(jìn)12.5dpc胎鼠卵巢細(xì)胞在體外培養(yǎng)中獲得體外重構(gòu)形成原始卵泡的能力。在無血清組織培養(yǎng)體系下，12.5dpc胎鼠卵巢自身可進(jìn)行卵巢細(xì)胞的分化并形成原始卵泡。而在該培養(yǎng)條件下，中腎組織的存在會(huì)導(dǎo)致卵巢細(xì)胞的正常分化受到抑制，

10、這主要表現(xiàn)為體細(xì)胞未能完成前顆粒細(xì)胞的分化，卵母細(xì)胞未能形成原始卵泡并完成最終分化。即在12.5dpc胚胎小鼠中，中腎組織對(duì)卵巢的分化具有作用，其作用的方向可能依賴于某些未知的因子和激素的存在。 連接蛋白被認(rèn)為對(duì)卵泡發(fā)育過程中的細(xì)胞間互作和信號(hào)傳遞具有重要的意義。在本實(shí)驗(yàn)中，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，我們系統(tǒng)的研究了在小鼠胚胎卵巢發(fā)育過程中連接蛋白26(Cx26)的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)，Cx26在胚胎卵巢發(fā)育的早期即可檢測(cè)到，并且在生

11、殖細(xì)胞之間存在差異表達(dá)。在大量卵泡形成啟動(dòng)前(18.5dpc)Cx26在生殖細(xì)胞之間的差異表達(dá)可能與原始卵泡形成的啟動(dòng)機(jī)制有關(guān)。而在原始卵泡形成時(shí)(1dpp)，Cx26在原始卵泡中生殖細(xì)胞的差異表達(dá)提示其可能并不參與原始卵泡形成時(shí)生殖細(xì)胞的選擇。Cx26在原始卵泡庫建立后直到性成熟卵巢中僅表達(dá)于卵母細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞的現(xiàn)象提示Cx26可能參與原始卵泡庫的最終建立。 綜上所述，本論文通過對(duì)原始卵泡形成時(shí)生殖細(xì)胞-體細(xì)胞間互作(發(fā)育階