人胚胎卵巢miRNA表達譜及miR-376a調控原始卵泡形成的研究.pdf

1、哺乳動物中，卵巢原始卵泡庫的大小決定了雌性在整個生育周期中用于生殖的卵母細胞數(shù)。因此，原始卵泡庫的形成對于雌性哺乳動物的生殖至關重要。在人類，這一過程的失調會導致多種生殖疾病，如原發(fā)性卵巢功能不全和不孕。越來越多的研究表明，原始卵泡形成受到了嚴格的轉錄和轉錄后水平的調控。作為廣泛被研究的轉錄后調控因子，microRNA(miRNA)在不同的細胞生物學過程（包括生殖）中都發(fā)揮著重要作用。miRNA成熟過程所必需的核酸內切酶Ⅲ——Dicer

2、的缺失，會導致雌性小鼠卵泡異常和不育。但是，在原始卵泡形成過程中，miRNA的生物學功能仍然知之甚少。組織特異性miRNA表達譜的建立，是我們研究已知和新的miRNA生物學功能的重要步驟。因此，我們利用Solexa深度測序技術，建立了正常人19～21周（原始卵泡形成活躍期）胚胎卵巢的miRNA表達譜，其中包括733條已知miRNAs和5條新miRNAs。在所有匹配到基因組的小RNA中，大部分的小RNA長度介于19-23nt，其中，22n

3、t長的小RNA所占比例最高，占所有小RNA的26.23％。我們對其中9條已知miRNAs的表達進行了熒光定量PCR實驗驗證，其結果與測序數(shù)據(jù)一致。通過對高豐度的和新的miRNAs預測的靶基因進行GO分析和KEGG信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因，參與了細胞粘附分子(Cell adhesion molecules，CAMs)介導的信號通路、mTOR信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路和Notch信號通路等，而這些信號通路已經(jīng)被證明在原始卵泡發(fā)生

4、過程中具有重要作用。這些發(fā)現(xiàn)為闡明miRNAs在卵泡發(fā)生中可能的調控作用，提供了基礎。
　　通過對正常人胚胎卵巢的miRNA表達譜研究，發(fā)現(xiàn)miR-376a可能調節(jié)增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，Pcna)。之前的研究顯示，Pcna通過調節(jié)卵母細胞凋亡進而影響小鼠原始卵泡形成，因此，對miR-376a和Pcna的調控進行了實驗驗證。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-376a和Pcn

5、a mRNA在原始卵泡形成前后，表達水平呈負相關。雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗證明了miR-376a可以直接結合在Pcna mRNA的3'非編碼區(qū)(3'Untranslted Region，3'UTR)。在培養(yǎng)的18.5 dpc小鼠卵巢中，轉染miR-376a mimics可以抑制Pcna mRNA和蛋白的表達，卵母細胞凋亡受到抑制，存活的卵母細胞數(shù)目增多，進而促進了原始卵泡的形成。這也是第一對被證明在原始卵泡形成過程中具有調控功能的miRN