miR-203在人表皮干細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控研究.pdf

1、表皮干細(xì)胞是皮膚組織中的特異性成體干細(xì)胞，主要位于表皮基底層和毛囊外根鞘膨凸部，具有極強的增殖、分化潛能及自我更新能力，在維持皮膚及其附屬器正常的結(jié)構(gòu)與功能、皮膚的創(chuàng)傷修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用。因此，表皮干細(xì)胞被認(rèn)為是構(gòu)建組織工程皮膚的理想種子細(xì)胞。充分了解表皮干細(xì)胞調(diào)控機制是其臨床應(yīng)用的重要前提和理論依據(jù)。國內(nèi)外現(xiàn)有研究主要集中在干細(xì)胞壁龕、Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、原癌基因和抑癌基因表達(dá)等途徑上，且已取得一定進(jìn)展，

2、但其確切機制還遠(yuǎn)未澄清。
　　研究表明，微小RNA（microRNA,miRNA)作為內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，在細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、器官發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、脂肪代謝、炎癥反應(yīng)、腫瘤形成、衰老與死亡及疾病的發(fā)生發(fā)展等許多生物過程中發(fā)揮重要作用。近期研究證實，miRNA廣泛參與調(diào)控皮膚及其附屬器的形成和穩(wěn)態(tài)，并與皮膚再生修復(fù)密切相關(guān)，其中miR-203在皮膚中存在特異性表達(dá)。但miRNA特別是 miR-203在人表皮干細(xì)胞

3、和角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)變化、作用及其調(diào)控機制，目前尚不十分清楚。
　　因此，本課題擬通過miRNA芯片檢測技術(shù)篩選體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞中miRNA的差異表達(dá)譜，并比較觀察miR-203與p63在人表皮干細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)變化，分析其相關(guān)性；通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-203抑制物導(dǎo)入體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞中，觀察下調(diào)miR-203誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成表皮樣干細(xì)胞的作用及其機制；通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將m

4、iR-203模擬物導(dǎo)入體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞中，觀察上調(diào)miR-203誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞向汗腺樣細(xì)胞分化的可能性。旨在進(jìn)一步明確 miR-203在人表皮干細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)變化、作用及其調(diào)控機制，為其在創(chuàng)面修復(fù)與皮膚組織工程中的應(yīng)用提供新思路及理論依據(jù)。
　　第一部分人表皮干細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞miRNA的差異表達(dá)譜分析
　　目的：觀察體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的差異，預(yù)測其靶基因與增殖分化的關(guān)系

5、。
　　方法:（1）取泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)患者的正常包皮組織，采用酶消化和Ⅳ型膠原快速貼壁方法獲得人表皮干細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀況，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法行β1整合素、CK1、CK10、CK19單抗檢測鑒定。（2）Trizol一步法分別提取2組細(xì)胞總 RNA，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢。mirVana?miRNA分離試劑盒對其進(jìn)行純化，使用miRNA標(biāo)記和雜交試劑盒進(jìn)行熒光標(biāo)記及芯片雜交，利用Feature Ex

6、traction(v10.7)軟件對雜交圖片進(jìn)行分析，GeneSpring(GXl0.0)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化及差異分析，同時應(yīng)用 RT-PCR法驗證miRNA芯片結(jié)果的可靠性。（3）預(yù)測部分差異表達(dá)的miRNA的靶基因。
　　結(jié)果：（1）快速黏附于Ⅳ型膠原的細(xì)胞群培養(yǎng)3 d能形成明顯克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示β1整合素及CK19呈陽性表達(dá)，為表皮干細(xì)胞；不能快速黏附于Ⅳ型膠原的細(xì)胞群培養(yǎng)3 d無明顯克隆形成，CK1及CK10呈陽性

7、表達(dá)，為角質(zhì)形成細(xì)胞。（2）篩選出人表皮干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的miRNA31個，表達(dá)下調(diào)的miRNA153個。其中顯著上調(diào)的miRNA有hsa-miR-125b-3p、hsa-miR-197-5p、hsa-miR-376a-3p等；顯著下調(diào)的 miRNA有 hsa-miR-203、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-3p等。其中上調(diào)的 hsa-miR-197-5p和下調(diào)的 hsa-miR-29b-3p的RT-PCR驗證結(jié)果

8、與芯片檢測結(jié)果具有較好的一致性。（3）miRNA靶基因預(yù)測提示部分miRNA與細(xì)胞增殖分化、凋亡衰老等生物學(xué)特性有關(guān)。
　　結(jié)論：體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞 miRNA表達(dá)譜存在明顯差異，可能與兩者不同的增殖分化能力等生物學(xué)特性有關(guān)。
　　第二部分 miR-203與p63在人表皮干細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)變化
　　目的：觀察miR-203與p63在體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)變化，探討其在表皮

9、增殖分化中的作用及意義。
　　方法：實時熒光定量 RT-PCR檢測體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞miR-203、p63 mRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測p63蛋白表達(dá)。對數(shù)據(jù)行t檢驗、Pearson相關(guān)分析。
　　結(jié)果：人表皮干細(xì)胞miR-203的mRNA相對表達(dá)量為0.74±0.20,較角質(zhì)形成細(xì)胞的3.66±0.34明顯下調(diào)（t=16.582，P＜0.001）。表皮干細(xì)胞p63的mRNA相對表達(dá)量為4.16±0.28較

10、角質(zhì)形成細(xì)胞的2.90±0.39明顯上調(diào)（ t=5.850， P=0.001）。表皮干細(xì)胞 p63的蛋白相對表達(dá)量為1.42±0.05,較角質(zhì)形成細(xì)胞的0.73±0.03明顯上調(diào)（t=26.460，P＜0.001）。miR-203的mRNA表達(dá)量與p63的mRNA和蛋白表達(dá)量均呈明顯負(fù)相關(guān)（r值分別為-0.938、-0.976，t值分別為4.687、7.763，P值分別為0.019、0.005）。
　　結(jié)論：miR-203在體外培

11、養(yǎng)人表皮干細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于角質(zhì)形成細(xì)胞，而 p63在人表皮干細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于角質(zhì)形成細(xì)胞，可能參與表皮干細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與分化。
　　第三部分 miR-203下調(diào)促進(jìn)人角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成表皮樣干細(xì)胞
　　目的：探討 miR-203下調(diào)促進(jìn)體外培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞去分化形成表皮樣干細(xì)胞的可能性及機制，為構(gòu)建組織工程皮膚促進(jìn)創(chuàng)面的解剖修復(fù)提供新的種子細(xì)胞來源。
　　方法：根據(jù)人源 miR-203序列，設(shè)計

12、并合成其單鏈抑制物。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將 miR-203抑制物導(dǎo)入體外培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞（實驗組），轉(zhuǎn)染對照miRNA抑制物作為對照組。對轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法行ITGB1、CK19、CK1、CK10單克隆抗體檢測鑒定；實時熒光定量RT-PCR檢測miR-203、p63、ITGB1、CK19、CK1、CK10 mRNA相對表達(dá)量；Western blot法檢測 p63、ITGB1、CK19、CK1、CK10蛋白相

13、對表達(dá)量；并對 miR-203的mRNA表達(dá)與 p63的 mRNA和蛋白表達(dá)分別行 Pearson相關(guān)分析。
　　結(jié)果：實驗組轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞ITGB1、CK19呈陽性表達(dá)。miR-203的mRNA相對表達(dá)量顯著低于轉(zhuǎn)染前，p63、CK19、ITGB1的mRNA及蛋白的相對表達(dá)量均高于轉(zhuǎn)染前及對照組，而CK1、CK10的mRNA及蛋白的相對表達(dá)量均低于轉(zhuǎn)染前和對照組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上述指標(biāo)對照組與轉(zhuǎn)染

14、前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。轉(zhuǎn)染前后 miR-203的 mRNA表達(dá)量與p63的mRNA和蛋白相對表達(dá)量均成負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：miR-203抑制物能誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞去分化為表皮樣干細(xì)胞，靶基因p63表達(dá)上調(diào)可能是其重要機制之一。
　　第四部分 miR-203轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)人表皮干細(xì)胞向汗腺樣細(xì)胞分化
　　目的：探討 miR-203轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞向汗腺樣細(xì)胞分化的可能性及機制，為

15、實現(xiàn)創(chuàng)面的功能愈合提供實驗依據(jù)及新途徑。
　　方法：通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將 miR-203模擬物導(dǎo)入體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞（實驗組），轉(zhuǎn)染對照miRNA模擬物作為對照組。對轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法行ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA單克隆抗體檢測鑒定；實時熒光定量RT-PCR檢測miR-203、p63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA mRNA相對表達(dá)量；Wester

16、n blot法檢測p63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA蛋白相對表達(dá)量；并對miR-203的mRNA表達(dá)與 p63的 mRNA和蛋白表達(dá)分別行 Pearson相關(guān)分析。
　　結(jié)果：實驗組轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞CK1、CK10、CK18、CEA呈陽性表達(dá)。miR-203 mRNA相對表達(dá)量顯著高于轉(zhuǎn)染前，CK1、CK10、CK18、CEA mRNA及蛋白的相對表達(dá)量均高于轉(zhuǎn)染前及對照組，而p63、CK19、I

17、TGB1 mRNA及蛋白的相對表達(dá)量均低于轉(zhuǎn)染前和對照組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上述指標(biāo)對照組與轉(zhuǎn)染前比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（ P＞0.05）。轉(zhuǎn)染前后miR-203的mRNA表達(dá)量與p63的mRNA和蛋白相對表達(dá)量均成負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：miR-203能誘導(dǎo)人表皮干細(xì)胞分化為汗腺樣細(xì)胞，其作用可能是通過靶向抑制p63來實現(xiàn)的。
　　全文小結(jié)：
　?。?）體外培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞與角質(zhì)形

18、成細(xì)胞miRNA表達(dá)譜存在明顯差異，可能與兩者不同的增殖分化能力等生物學(xué)特性有關(guān)。
　?。?） miR-203在體外培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于角質(zhì)形成細(xì)胞，而p63在人表皮干細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于角質(zhì)形成細(xì)胞，miR-203與p63基因及蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。p63的mRNA可能是miR-203的靶基因，miR-203可能通過抑制p63參與調(diào)控表皮細(xì)胞的增殖分化。
　?。?） miR-203下調(diào)能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)