miR-203靶向SMAD3影響大鼠肝星狀細胞膠原合成與增殖.pdf

1、肝星狀細胞(HSCs)活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，活化后的肝星狀細胞是纖維性膠原蛋白等細胞外基質(ECM)成分的主要來源。抑制HSCs活化增殖及ECM合成與沉積是目前研究抗纖維化治療的策略之一。有研究表明microRNAs(miRNAs)在HSCs活化增殖過程及ECM合成方面起到重要的調節(jié)作用。
　　目的:
　　本研究在細胞水平探索miR-203對大鼠肝星狀細胞增殖及膠原合成的影響的機制研究。
　　方法:

2、　　第一部分:
　　miR-203對大鼠肝星狀細胞增殖及膠原合成的影響
　　1.大鼠肝星狀細胞系(HSC-T6)分為三組:分別轉染miR-203 mimics（相似物），miR-203 inhibitor（抑制物）及無關miRNA（scramble miRNA），轉染介質為lipofectamine2000。瞬時轉染48h后分別提取總RNA和總蛋白;
　　2.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測每組miR-203，

3、Ⅰ型膠原蛋白(COL1A1)，Ⅲ型膠原蛋白(COL3A1)及α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）信使RNA(mRNA)表達情況;
　　3.Western Bolt檢測每組COL1A1，COL3A1及α-SMA蛋白表達情況。
　　4.MTT法檢測每組HSCs細胞增殖情況。
　　第二部分:
　　miR-203對大鼠肝星狀細胞SMAD3表達的影響及miR-203與SMAD3的靶向關系檢測
　　1.HSC-T6分為三組:

4、分別轉染miR-203 mimics，miR-203 inhibitor及無關miRNA（scramble miRNA），轉染介質為lipofectamine2000。提取總RNA和總蛋白用于后續(xù)檢測;
　　2.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測每組miR-203及SMAD3 mRNA的表達情況;
　　3.western blot檢測SMAD3蛋白的表達情況
　　4.生物信息學預測SMAD3是miR-203的靶基

5、因，雙熒光素酶報告基因試驗檢測miR-203與SMAD3之間的靶向關系。
　　結果:
　　第一部分:
　　1.miR-203 mimics組與對照組（Scramble組）相比miR-203表達明顯增加， miR-203 inhibitor組miR-203表達則顯著下調;miR-203 mimics組COL1A1，COL3A1及α-SMA的mRNA及蛋白表達較Scramble組明顯減少，miR-203inhibitor組

6、COL1A1，COL3A1及α-SMA mRNA及蛋白表達則明顯增加。
　　2.MTT試驗結果提示上調miR-203表達抑制HSCs增殖，下調miR-203表達則促進HSCs增殖;
　　第二部分:
　　1.miR-203 mimics組與對照組(Scramble組)相比miR-203表達明顯增加，miR-203 inhibitor組miR-203表達則顯著下調;miR-203 mimics組SMAD3的mRNA及蛋白表