大鼠TGF-β3基因的克隆及其對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF-β1和I型膠原合成的影響.pdf

1、本研究分為二部分：第一部分、大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3基因的克隆及其在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 目的：克隆大鼠TGF-β3基因并觀察其在轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)后的表達(dá)情況。
　　 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從大鼠成骨細(xì)胞中擴(kuò)增出特異性片段，經(jīng)酶切鑒定證實(shí)為大鼠TGF-β3cDNA，將此片段插入pcDNA3.1(+)表達(dá)載體，構(gòu)建得到pcDNA3.1(+)-TGF-β3重組質(zhì)粒。應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)

2、體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將TGF-β3表達(dá)載體導(dǎo)入HSC-T6，在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，用熒光定量PCR法進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)的檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 ①重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TGF-β3經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI、XbaI酶切，電泳后顯示1.2kb的TGF-β3目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(+)載體片段，經(jīng)測(cè)序證實(shí)酶切片段與GenBank中登記的TGF-β3序列相同，證實(shí)pcDNA3.1(+)-

3、TGF-β3真核表達(dá)載體構(gòu)建成功；
　　 ② pcDNA3.1(+)-TGF-β3轉(zhuǎn)染HSC-T6后，24h、48h、72hTGF-β3 mRNA的表達(dá)較空白組及對(duì)照組增高，以48h增高最為明顯(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：重組TGF-β3真核表達(dá)載體構(gòu)建正確，并在轉(zhuǎn)染HSC-T648h后可獲得高效表達(dá)，為轉(zhuǎn)基因治療纖維化疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第二部分、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF-β1、I型膠原

4、合成的影響。
　　 目的：觀察大鼠TGF-β3基因?qū)Ω涡菭罴?xì)胞株(HSC-T6)TGF-β1和I型膠原合成的影響。
　　 方法：構(gòu)建TGF-β1表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1(+)-TGF-β1)。通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將pcDNA3.1(+)-TGF-β1轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HSC-T6，經(jīng)G418篩選建立高表達(dá)TGF-β1的HSC-T6細(xì)胞克隆，一月后熒光定量PCR及Western blot法鑒定。用pcDNA3.1(+)-T

5、GF-β3轉(zhuǎn)染該細(xì)胞，熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后TGF-β1、I型膠原mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)TGF-β1、I型膠原蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染大鼠pcDNA3.1(+)-TGF-β1質(zhì)粒的克隆細(xì)胞，其TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)較空白組及對(duì)照組明顯增高(P＜0.05)；I型膠原mRNA及蛋白表達(dá)亦明顯增高(P＜0.05)。TGF-β3基因轉(zhuǎn)染克隆細(xì)胞后，TGF-β1mRNA表達(dá)與克隆組相比無(wú)明