胃癌miRNA表達(dá)譜的鑒定及miR-374b-5p的功能研究.pdf

1、目的:
　　通過鑒定與人胃癌密切相關(guān)的microRNAs(miRNAs)表達(dá)譜，初步篩選出在人胃癌細(xì)胞株中高表達(dá)的miRNAs；探討miR-374b-5p、RECK與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的關(guān)系，進(jìn)一步闡明miR-374b-5p在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株 SGC-7901、MGC-803、NCI-N87和正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，分別提取總RNA進(jìn)行miRNA芯片分析；qRT

2、-PCR技術(shù)驗(yàn)證部分差異表達(dá)的miRNA。
　　2.通過生物信息網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)預(yù)測(cè)目的miRNA的作用靶點(diǎn)。設(shè)計(jì)合成has-miR-374b-5p ASODA，將其轉(zhuǎn)染于人胃癌細(xì)胞株MGC-803，以空載體和無關(guān)寡核苷酸序列為對(duì)照。qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；CCK-8法觀察胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的生長(zhǎng)情況；Trans-well小室法和劃痕試驗(yàn)觀察胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的侵襲和遷移影響；qRT-PCR驗(yàn)證RECK表達(dá)變化；Western Blot法驗(yàn)證

3、RECK蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.微陣列芯片可見，相對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1，共有115個(gè)miRNAs在胃癌細(xì)胞株中存在兩倍及以上差異表達(dá)；其中在NCI-N87細(xì)胞中27個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)、25個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)，在SGC-7901細(xì)胞中21個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)、8個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)，在 MGC-803細(xì)胞中19個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)、15個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。選取MGC-803細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的miR

4、-374b-5p、miR-182-5p、miR-15-5p進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，證明芯片結(jié)果基本可信。miR-374b-5p在MGC-803細(xì)胞中明顯高表達(dá)。
　　2.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，RECK可能為miR-374b-5p的靶基因。MGC-803細(xì)胞以Lipofectamin2000為轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率在80％左右。轉(zhuǎn)染miR-374b-5p抑制劑后，胃癌細(xì)胞miR-374b-5p表達(dá)顯著降低。轉(zhuǎn)染后miR-374b-

5、5p抑制組較對(duì)照組的抑制率明顯增高。轉(zhuǎn)染hsa-miR-374b-5p抑制劑后細(xì)胞侵襲和遷移的能力均下降。qRT-PCR發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組RECK的mRNA明顯上升；Western Blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組RECK蛋白表達(dá)上升。
　　結(jié)論:
　　1.初步篩選出109個(gè)與人胃癌相關(guān)miRNAs。
　　2.miR-374b-5p可能在人胃癌中高表達(dá)。
　　3.miR-374b-5p可能通過RECK通路調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移