白紋伊蚊miRNA的測(cè)序、鑒定及表達(dá)譜的初步分析.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類大小約21-23個(gè)堿基的單鏈小分子非編碼RNA,能夠通過(guò)與靶mRNA特異性的堿基配對(duì)引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯,從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控[1]。大多數(shù)miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而來(lái),形成一個(gè)長(zhǎng)度約幾百至上千個(gè)堿基的初級(jí)轉(zhuǎn)錄木primarymiRNA(pri-miRNA)[2-4],primary miRNA既可以是單順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)形成一個(gè)成熟的miRNA,也可以是多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)產(chǎn)生多個(gè)

2、成熟miRNAs[2,5]。在果蠅中primarymiRNA在核內(nèi)被核糖核酸酶Drosha-Pasha復(fù)合物加工處理而最終成為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體pre-miRNA(precursor miRNA),之后pre-miRNA被核輸出蛋白exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)入胞質(zhì),接著被第二個(gè)核糖核酸酶Dicer-1消化為miRNA:miRNA*雙鏈復(fù)合物,隨后由解螺旋酶將其分解成兩條單鏈[6,7],多數(shù)情況下miRNA

3、*鏈快速降解而另一條鏈則成為成熟的miRNA,這個(gè)階段的miRNA可以結(jié)合RISC(RNA-Induced Silencing Complex)并與靶標(biāo)mRNA的3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì),miRNA和靶序列的互補(bǔ)程度決定了靶基因mRNA或者在翻譯水平被抑制,或者被降解[2]。植物體中降解是主要的工作方式,而哺乳動(dòng)物中則以翻譯水平的抑制為主要方式。
　　 miRNA廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒等多種生物物種中。研究表明大多數(shù)miR

4、NA在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守,并且其表達(dá)具有時(shí)序性和組織特異性[2],現(xiàn)已證實(shí)miRNA參與和調(diào)控了包括細(xì)胞凋亡、癌癥發(fā)生、組織分化、發(fā)育、神經(jīng)元發(fā)育、炎癥、病毒感染等多個(gè)生理病理過(guò)程[8-13]。
　　 昆蟲miRNA的研究最早主要是以果蠅為模型展開,據(jù)推測(cè),在果蠅的不同發(fā)育階段約有110種不同的miRNAs表達(dá)[14],通過(guò)軟件預(yù)測(cè)與同源比對(duì)分析的方法在岡比亞按蚊中發(fā)現(xiàn)66種miRNAs[15,16]。在斯氏按蚊miRNA研

5、究方面,通過(guò)小規(guī)模的測(cè)序以及Northern blot的方法首次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了蚊蟲中miRNA的存在[17]。隨著近年來(lái)新一代高通量測(cè)序技術(shù)在small RNA研究領(lǐng)域的應(yīng)用,研究者已經(jīng)對(duì)埃及伊蚊以及致卷庫(kù)蚊的miRNA進(jìn)行了深度測(cè)序分析[18,19]。到目前為止,在蚊蟲中共發(fā)現(xiàn)miRNA上百種,其中部分miRNA目前只在蚊蟲中發(fā)現(xiàn),尚未在其他物種中發(fā)現(xiàn)。通過(guò)對(duì)miRNA在蚊蟲從蟲卵到成蚊不同發(fā)育階段的表達(dá)譜分析,以及在雌蚊吸血前后的表達(dá)變

6、化,發(fā)現(xiàn)miRNA可能在蚊蟲的胚胎發(fā)育、組織分化、病原體感染過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用[17,18]。對(duì)蚊蟲中miRNA功能以及作用機(jī)制的進(jìn)一步了解,將有助于我們對(duì)蚊蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、經(jīng)蚊蟲傳播的病原體感染等方面的研究。
　　 白紋伊蚊是登革病毒的重要傳播媒介,廣泛分布于我國(guó)南方大部以及東南亞地區(qū)[20]。2010年Rebecca L等[19]對(duì)白紋伊蚊C7/10細(xì)胞miRNA進(jìn)行了深度測(cè)序,共鑒定出65種miRNAs。但有關(guān)白

7、紋伊蚊成蚊miRNA的研究尚未見報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)研究利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)solexa測(cè)序?qū)Π准y伊蚊不同發(fā)育階段混合樣本的小RNA進(jìn)行了深度測(cè)序,并通過(guò)后續(xù)的生物信息學(xué)分析鑒定并預(yù)測(cè)了上百種miRNAs,并且通過(guò)Northern blot的方法對(duì)部分miRNAs做了白紋伊蚊不同發(fā)育階段的表達(dá)譜分析以及在雌蚊吸血前后的表達(dá)變化。通過(guò)分析顯示miRNAs與白紋伊蚊的胚胎發(fā)育、變態(tài)發(fā)育以及吸血進(jìn)程有關(guān),對(duì)其靶標(biāo)的預(yù)測(cè)以及作用機(jī)制的進(jìn)一步研究,將

8、有助于我們對(duì)白紋伊蚊各種生物學(xué)特性的了解,為將來(lái)的蚊蟲防控工作打下基礎(chǔ)。
　　 研究目的:
　　 1.通過(guò)新一代高通量測(cè)序技術(shù)solexa測(cè)序,對(duì)白紋伊蚊整個(gè)物種進(jìn)行小RNA深度測(cè)序,并通過(guò)后續(xù)的生物信息學(xué)分析,對(duì)測(cè)得的每一條小RNA序列進(jìn)行注釋,鑒定己知miRNA與目前尚未發(fā)現(xiàn)的新型miRNA。
　　 2.根據(jù)測(cè)序結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)選取部分miRNA,通過(guò)Northern blot的方法實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證白紋伊蚊中miRNA

9、的存在并對(duì)其不同發(fā)育階段做表達(dá)譜分析。對(duì)部分miRNA研究其在雌蚊吸血前后的表達(dá)變化。
　　 研究方法:
　　 1 白紋伊蚊small RNA的solexa測(cè)序
　　 1.1 白紋伊蚊樣本的收集
　　 分別收集12-24h蟲卵、早期幼蟲、晚期幼蟲、蟲蛹、羽化3-5天雄蚊、雌蚊等六個(gè)不同階段樣本。
　　 1.2 Total RNA的提取與鑒定
　　 將不同階段樣本收集后放液氮冷凍十分鐘,然后

10、用Trizol提取各個(gè)不同階段樣本的Total RNA,核酸測(cè)量?jī)x檢測(cè)濃度及純度,15％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定所提Total RNA的質(zhì)量。
　　 1.3測(cè)序
　　 樣品首先通過(guò)生物分析儀Agilent Bioanalyzer進(jìn)行檢測(cè),樣品合格后,首先將18-30 nt范圍的small RNA從Total RNA中分離出來(lái),兩端分別加上特定接頭后體外反轉(zhuǎn)錄做成cDNA再做RT-PCR擴(kuò)增,然后利用測(cè)序儀對(duì)DNA片

11、段進(jìn)行單向末端直接測(cè)序。
　　 1.4基本生物信息學(xué)分析
　　 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行去接頭、去低質(zhì)量、去污染等處理,得到去雜質(zhì)的“干凈”序列,用于后續(xù)的高級(jí)分析。
　　 1.5高級(jí)生物信息學(xué)分析
　　 通過(guò)與rRNAetc(rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA 等non-coding RaNAs)、已知的miRNA、repeat、exon/intron等降解片段的比對(duì),將每條小RNA序列進(jìn)行注釋。選擇沒(méi)

12、有比對(duì)上任何注釋信息的小RNA和與intron關(guān)聯(lián)的小RNA去預(yù)測(cè)新的miRNA。
　　 2.白紋伊蚊miRNA的表達(dá)譜分析以及雌蚊吸血前后的表達(dá)差異分析
　　 2.1 白紋伊蚊各個(gè)不同階段樣本的收集
　　 分別收集12-24h蟲卵、早期幼蟲、晚期幼蟲、蟲蛹、羽化3-5天雄蚊、未吸血雌蚊等六個(gè)不同發(fā)育階段樣本。
　　 2.2 Total RNA的提取與鑒定
　　 將不同階段樣本收集后放液氮冷凍10

13、min,然后按照mirVanaTM miRNAIsolation Kit中 Total RNA提取的相關(guān)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn),核酸測(cè)量?jī)x檢測(cè)濃度及純度,15％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定所提Total RNA的質(zhì)量。
　　 2.3 白紋伊蚊不同發(fā)育階段的miRNA表達(dá)譜分析
　　 分別取等質(zhì)量的六個(gè)不同發(fā)育階段樣本的Total RNA,依次進(jìn)行電泳、半干轉(zhuǎn)印、交聯(lián)、雜交、洗膜、曝光檢測(cè)。
　　 2.4雌蚊吸血前后miR

14、NA的表達(dá)差異分析
　　 分別取等質(zhì)量的吸血與未吸血雌蚊樣本的Total RNA,依次進(jìn)行電泳、半干轉(zhuǎn)印、交聯(lián)、雜交、洗膜、曝光檢測(cè)。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.通過(guò)對(duì)白紋伊蚊小RNA的深度測(cè)序以及生物信息學(xué)分析,共測(cè)得序列12663936條,1801570種。其中通過(guò)與miRBase14.0數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析得到92種已知miRNAs,通過(guò)miRNA預(yù)測(cè)軟件mireap預(yù)測(cè)新的miRNAs 46種。
　　

15、 2.miRNA在白紋伊蚊不同發(fā)育階段的表達(dá)譜分析共選擇12種miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證,包括6種保守性miRNAs與6種蚊蟲特異性miRNAs。所有的miRNAs在白紋伊蚊中均得到驗(yàn)證,并且大多數(shù)miRNA在蚊蟲的不同發(fā)育階段具有表達(dá)差異。
　　 3.miRNA在白紋伊蚊雌蚊吸血前后的表達(dá)差異共選擇4種miRNAs(miR-184、miR-998、miR-989、miR-N1)做吸血前后的表達(dá)差異分析,其中3種miRNAs在雌蚊吸血

16、后表達(dá)水平增加,miR-N1在雌蚊吸血后才開始有表達(dá)。
　　 研究結(jié)論:
　　 1.通過(guò)solexa高通量測(cè)序技術(shù),首次對(duì)白紋伊蚊這一物種的小RNA進(jìn)行了深度測(cè)序,通過(guò)測(cè)序以及生物信息學(xué)分析共鑒定出已知miRNA 92種,預(yù)測(cè)新的miRNA 46種。
　　 2.通過(guò)Northern blot的方法,實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了白紋伊蚊中miRNA的存在,并且通過(guò)對(duì)白紋伊蚊不同發(fā)育階段的表達(dá)譜分析,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA表達(dá)具有期特異