氧誘導新生小鼠視網(wǎng)膜病變miRNA表達譜的初步研究.pdf

1、研究目的:
　　本研究旨在對氧誘導的視網(wǎng)膜病變組織差異表達的miRNAs進行初步的研究，為進一步研究miRNAs對視網(wǎng)膜新生血管的調(diào)控機制奠定基礎。
　　研究方法:
　　本研究共分四個部分
　　第一部分：OIR模型制備。實驗組采用C57BL/6J新生幼鼠，生后第7天飼養(yǎng)在75±2％氧濃度環(huán)境中5天，返回正常空氣環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5天。對照組新生幼鼠在正?？諝猸h(huán)境中飼養(yǎng)。實驗組與對照組各隨機選取24個視網(wǎng)膜組織進行下一

2、步實驗。
　　第二部分：OIR組織差異表達miRNAs的篩選。實驗組與對照組隨機各選10個視網(wǎng)膜標本進行混樣，提取樣本的總 RNA，采用 LC Sciences公司的uParaflo微流體miRNA芯片進行高通量篩選。根據(jù)預設條件，篩選出miRNAs作為研究對象進行第三部分研究。
　　第三部分：OIR組織差異表達 miRNAs的初步驗證。實驗組與對照組隨機各選20個視網(wǎng)膜標本，采用TaqMan qRT-PCR的方法對篩選出的

3、兩種候選miRNAs進行定量研究和驗證，比較在兩組間各miRNAs表達水平的差異是否與芯片結果一致。
　　第四部分：對篩選出差異表達的miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p進行生物信息學分析。
　　實驗結果:
　　第一部分：實驗組與對照組通過眼球切片觀察玻璃體腔突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜內(nèi)皮細胞核數(shù)目，以及高分子量熒光素灌注法觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)，證實氧誘導視網(wǎng)膜病變模型的成功建立。
　　第二部分：
　

4、　1、兩組視網(wǎng)膜樣本均可提取出合格的RNA
　　分別從實驗組及對照組視網(wǎng)膜中提取總RNA，采用分光光度法檢測OD260/280，比值均符合要求。
　　2、總RNA與miRNA芯片雜交
　　用實驗組及對照組提取出的總RNA與miRNA芯片雜交，得到2張成像均勻、清晰的雜交圖像，可證實總RNA中含有miRNAs。
　　3、miRNAs在實驗組及對照組中表達存在差異
　　采用GenePix pro V6.0軟件，

5、對探針點的初始熒光強度進行分析，然后對初始強度值進行標準化處理，篩選出兩組間差異表達的miRNAs。以表達水平變化倍數(shù)R≥2為界，共有31種差異表達的miRNAs，其中21種在實驗組相對于對照組上調(diào),10種下調(diào)。
　　4、篩選出兩種候選miRNAs
　　以表達水平變化倍數(shù)R≥2為界，選擇P值＜0.001以及信號值大于500，最后篩選出兩種miRNA進行第三部分實驗。
　　第三部分：
　　1、各視網(wǎng)膜標本中均可提取

6、出合格的RNA兩組視網(wǎng)膜標本提取總RNA，OD260/280的比值均符合要求。
　　2、候選miRNAs的初步驗證與篩選以U6 SnRNA為內(nèi)參，對各miRNAs的表達水平進行標準化分析，通過統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，第二部分實驗中篩選出的miRNA-130a-3p、miRNA-5107-5p在視網(wǎng)膜組織中的表達存在顯著性差異，與芯片結果一致。
　　第四部分：對miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p進行生物信息學分析，

7、發(fā)現(xiàn)miR-5107-5p靶基因顯著富集于ABC轉運子,甲狀腺癌通路。miR-130a-3p靶基因顯著富集于甘油脂類代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白加工、Notch信號通路、磷脂酰肌醇信號通路、甘油磷脂代謝等通路中。
　　結論:
　　1、通過氧誘導方法，可以成功建立OIR模型。
　　2、芯片檢測發(fā)現(xiàn)，某些 miRNAs的組織表達水平在實驗組及對照組之間存在顯著性差異,本實驗篩選出67種差異表達的miRNA，其中35種在實驗組相對于對