蛋白激酶B(Akt)促進(jìn)氧誘導(dǎo)的鼠視網(wǎng)膜新生血管形成的初步研究.pdf

1、第一章：氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型鼠視網(wǎng)膜中蛋白激酶B(Akt)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化
　　 目的：檢測(cè)氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠視網(wǎng)膜Akt和磷酸化Akt(pAkt)的蛋白及(Akt)mRNA表達(dá)，探討其動(dòng)態(tài)變化和意義。
　　 方法：出生后第7(P7)天的C57/BL6小鼠102只隨機(jī)分為模型組(51只)正常組(51只)，模型組小鼠和母鼠一起放入氧氣含量為(75％±2％)的飼養(yǎng)箱中飼養(yǎng)5天，第12天(P12)回到正常大氣環(huán)境中飼養(yǎng)。正

2、常組小鼠和母鼠一直置于正常大氣環(huán)境中飼養(yǎng)。第17天取模型組和正常組各3只小鼠分別做FITC-Dextran造影視網(wǎng)膜鋪片。分別提取模型組和正常組小鼠出生后在第7(P7)，9(P9)，11(P11)天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，和第12(P12)，14(P14)，16(P16)，17(P17)，23(P23)天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各3只小鼠)的視網(wǎng)膜總RNA及蛋白，用Western blot及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中Akt表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。<

3、br>　　 結(jié)果：FITC-Dextran造影視網(wǎng)膜鋪片示：與正常組小鼠視網(wǎng)膜比較，模型組小鼠可見(jiàn)到圍繞著視乳頭有大面積的無(wú)灌注區(qū)，血管高度不規(guī)則擴(kuò)張，走形迂曲，有新生血管叢，并可見(jiàn)熒光滲漏。
　　 模型組鼠視網(wǎng)膜組織中的(Akt)mRNA在第7(P7)，9(P9)，11(P11)天灰度值分別為0.096±0.012、0.056±0.011、0.021±0.010(P<0.05)，呈下降趨勢(shì)；而在第12(P12)，14(P14

4、)，16(P16)，17(P17)，23(P23)天灰度值分別為0.278±0.014、0.524±0.015、0.659±0.013、0.842±0.016、0.421±0.002(P<0.05)，呈上升趨勢(shì)，并在P17達(dá)到高峰。在正常組中(Akt)mRNA的表達(dá)無(wú)明顯趨勢(shì)(P>0.05)。
　　 模型鼠視網(wǎng)膜組織中Akt蛋白質(zhì)表達(dá)水平第7(P7)，9(P9)，11(P11)天灰度值分別為1.080±0.210、0.535±0

5、.152、0.206±0.124(P<0.05)，呈下降趨勢(shì)；而在第12(P12)，14(P14)，16(P16)，17(P17)，23(P23)天灰度值分別為0.249±0.110、0.481±0.152、0.704±0.240、0.978±0.270、0.491±0.161(P<0.05)，呈上升趨勢(shì)，并在P17達(dá)到高峰。在正常組中Akt蛋白質(zhì)的表達(dá)無(wú)明顯趨勢(shì)(P>0.05)。
　　 模型鼠視網(wǎng)膜組織中p-Akt蛋白質(zhì)表達(dá)水

6、平第7(P7)，9(P9)，11(P11)天灰度值分別為0.864±0.141、0.482±0.110、0.162±0.082(P<0.05)，呈下降趨勢(shì)；而在第12(P12)，14(P14)，16(P16)，17(P17)，23(PEa)天灰度值分別為0.086±0.013、0.099±0.017、0.164±0.021、0.208±0.031、0.042±0.014(P<0.05)，呈上升趨勢(shì)，并在P17達(dá)到高峰。在正常組中p-Ak

7、t蛋白質(zhì)的表達(dá)無(wú)明顯趨勢(shì)(P>0.05)。
　　 結(jié)論：(Akt)mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠視網(wǎng)膜中，高氧環(huán)境下明顯下降，在缺氧環(huán)境下明顯上調(diào)。
　　 第二章:外源性Akt抑制高氧環(huán)境下誘發(fā)的鼠視網(wǎng)膜血管丟失的研究
　　 目的:檢測(cè)活性重組體Akt對(duì)高氧環(huán)境下視網(wǎng)膜血管丟失的抑制作用，探討Akt信號(hào)通路對(duì)視網(wǎng)膜血管的保護(hù)作用。
　　 方法:在P6和P7天，C57BL6小鼠8只通過(guò)腹腔注

8、射戊巴比妥鈉麻醉，并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各4只。實(shí)驗(yàn)組小鼠4只于玻璃體腔內(nèi)注射lul活性重組體Akt，對(duì)照組小鼠4只玻璃體腔內(nèi)注射PBS。將兩組小鼠共8只置于濃度為75％±2％高氧艙環(huán)境中生活。在P8天，F(xiàn)ITC-dextran左心室造影視網(wǎng)膜鋪片了解視網(wǎng)膜的無(wú)灌注區(qū)的改變。
　　 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組小鼠玻璃體腔內(nèi)注射活性重組體Akt后，視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示無(wú)灌注區(qū)面積/全視網(wǎng)膜面積為32％，對(duì)照組玻璃體腔內(nèi)注射PBS后無(wú)灌注區(qū)面積/

9、全視網(wǎng)膜面積為13％。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論:高氧環(huán)境下運(yùn)用外源性Akt矯正Akt的缺乏能夠抑制視網(wǎng)膜血管的丟失，減少無(wú)灌注區(qū)。
　　 第三章:Akt抑制劑在低氧環(huán)境下抑制鼠視網(wǎng)膜新生血管形成的研究
　　 目的:觀察Akt抑制劑(1 L-6-hydroxymethyl-chiro-inositol2-(R)-2-0-methyl-3-Ooctadecylcarbonate)對(duì)低氧環(huán)境下視

10、網(wǎng)膜新生血管形成的抑制作用，探討Akt活性的抑制對(duì)于新生血管抑制的作用。
　　 方法:將鼠齡為7天的C56BL/6小鼠14只置于濃度為75％±2％高氧艙環(huán)境中生活5天，然后返回正常氧環(huán)境中。小鼠于出氧艙后當(dāng)日被隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各7只，實(shí)驗(yàn)組小鼠玻璃體腔內(nèi)注射1.SulAkt抑制劑，對(duì)照組小鼠玻璃體腔內(nèi)注射1.5ulPBS。在P17天，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各取4只小鼠FITC-dextran左心室造影視網(wǎng)膜鋪片了解視網(wǎng)膜的血管形態(tài)

11、的改變。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各3只小鼠組織學(xué)切片觀察突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量。
　　 結(jié)果:視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜新生血管的面積/全視網(wǎng)膜面積為6％，對(duì)照組的視網(wǎng)膜新生血管的面積/全視網(wǎng)膜面積為14％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但兩組的無(wú)灌注區(qū)無(wú)明顯差異(實(shí)驗(yàn)組無(wú)灌注區(qū)面積/全視網(wǎng)膜面積為21％，對(duì)照組無(wú)灌注區(qū)面積/全視網(wǎng)膜面積為22％ ，P>0.05);組織學(xué)切片結(jié)果表明與對(duì)照組相比較，Akt抑制劑注射