氧誘導視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制研究.pdf

1、早產兒視網(wǎng)膜病變(retinopathyofprematurity,ROP)是一種增生性視網(wǎng)膜病變，是兒童主要致盲眼病之一。據(jù)報道ROP在我國早產兒的患病率為20.3％。氧損傷破壞不成熟的視網(wǎng)膜血管組織，造成視網(wǎng)膜的缺血、缺氧；并因而代償性的產生不成熟的滲漏血管，即異常視網(wǎng)膜新生血管的形成，大量異常血管的增生會導致視網(wǎng)膜血管突破內界膜，甚至深入玻璃體腔，從而引發(fā)玻璃體出血以及牽拉型視網(wǎng)膜脫離，最終致盲。由此可見導致ROP的主要病理改變是

2、異常視網(wǎng)膜新生血管的形成。然而迄今，其確切的形成機制尚不完全清楚。本研究通過對小鼠氧干預后引發(fā)氧誘導視網(wǎng)膜病變(oxygen-inducedretinopathy,OIR)，模擬人類早產兒視網(wǎng)膜病變；并通過此模型進一步了解ROP的發(fā)病機制。 第一部分氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管熒光素灌注造影及量化檢測[目的]通過氧環(huán)境的改變誘導小鼠產生視網(wǎng)膜新生血管，模擬人類早產兒視網(wǎng)膜病變，并利用高分子量熒光素灌注造影以及組織切片觀察OIR模型視

3、網(wǎng)膜血管的形態(tài)及改變程度。 [方法]1.模型制作：將7日齡C57BL/6J幼鼠放入75％±2％濃度的高氧狀態(tài)下飼養(yǎng)5天，隨后在正常氧環(huán)境下飼養(yǎng)5天，作為OIR模型組；同齡C57BL/6J幼鼠作為正常對照組。 2.小鼠視網(wǎng)膜新生血管熒光素灌注造影：在出生后12、14、17天(P12,14,17)，向氧誘導視網(wǎng)膜病變模型小鼠的心臟灌注相對高分子量的熒光素，眼球經過組織固定后，通過顯微手術鏡游離視網(wǎng)膜并鋪片，在熒光顯微鏡下觀察

4、視網(wǎng)膜血管的分布與形態(tài)。 3.視網(wǎng)膜新生血管量化：生后12、14、17天(P12,14,17)處死小鼠，組織切片方法觀察各組視網(wǎng)膜血管的變化，計數(shù)突破內界膜的血管內皮細胞核以量化氧誘導視網(wǎng)膜病變新生血管的程度。 [結果]1.C57BL/6J幼鼠經氧誘導之后，可產生連續(xù)的視網(wǎng)膜新生血管改變，并且有很好的重復性。 2.在熒光顯微鏡下可以清楚地觀察整個視網(wǎng)膜血管形態(tài)、走行；通過調節(jié)焦點視網(wǎng)膜淺層、深層以及二者交通支都清

5、晰顯影。高氧誘導的視網(wǎng)膜新生血管主要發(fā)生在視網(wǎng)膜有血管區(qū)與無血管區(qū)的交界部位，可見滲出、出血、微血管瘤的表現(xiàn)。并可清楚反映隨時間延長發(fā)生的血管改變。 3.組織切片顯示OIR模型在不同時間點突破內界膜(internallimitingmembrane,ILM)的血管內皮細胞數(shù)逐漸增多。 [結論]1.暴露在高氧環(huán)境的C57BL/6J幼鼠經過相對低氧后，100％產生視網(wǎng)膜新生血管的改變，形成的OIR模型可以模擬人類早產兒視網(wǎng)膜

6、病變。 2.通過高分子量熒光素灌注造影可以清晰、準確的動態(tài)了解視網(wǎng)膜新生血管模型小鼠眼底血管的病變部位及形態(tài)學改變。可以較好地應用于視網(wǎng)膜新生血管性疾病的基礎研究。 3.視網(wǎng)膜血管熒光素灌注以及組織切片方法均顯示：隨著時間的延續(xù)，OIR模型的視網(wǎng)膜新生血管逐漸增多，病變程度有加重趨勢。 第二部分血管內皮生長因子與色素上皮衍生因子在氧誘導視網(wǎng)膜病變中表達及意義 [目的]應用小鼠氧誘導視網(wǎng)膜病變模擬早產兒視網(wǎng)

7、膜病變，通過分子生物學技術觀測血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)與色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderivedfactor，PEDF)在視網(wǎng)膜新生血管的表達，探討早產兒視網(wǎng)膜病變的可能發(fā)病機制。 [方法]1.模型制作：將7日齡C57BL/6J幼鼠放入75％±2％濃度的高氧狀態(tài)下飼養(yǎng)5天，隨后在正常氧環(huán)境下飼養(yǎng)5天，作為OIR模型組；同齡C57BL/6

8、J幼鼠作為正常對照組。 2.在核酸水平的表達：分別于生后12、14、17天(高氧后0、2、5天)處死模型小鼠，采用逆轉錄一聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，半定量觀察各時間點VEGFmRNA，PEDFmRNA在視網(wǎng)膜新生血管中的變化。 3.在蛋白水平的表達：分別于生后12、14、17天(高氧后0、2、5天)處死模型小鼠，采用Westernblot方法，觀察不同時間點視網(wǎng)膜新生血管中VEGF，PEDF蛋白表達的情況。

9、 [結果]1.伴隨著視網(wǎng)膜組織的缺氧，出現(xiàn)了VEGF蛋白表達的升高以及PEDF表達的降低，導致VEGF/PEDF比率的升高，兩者改變都在高氧17天達到頂峰。 2.VEGFmRNA水平升高；PEDFmRNA水平下降，兩者改變都在高氧14天達到最大，較蛋白改變均提前3天(p17)發(fā)生。 3.VEGF/PEDF比率升高，伴隨著同一時期視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生以及其嚴重程度的加重而逐漸增加。 [結論]1.在蛋白水平，VEGF