P16、CyclinD1和CDK4在大鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變中的表達及作用機制.pdf

1、目的：
　　 1.建立大鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型,通過氧環(huán)境的改變誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生視網(wǎng)膜新生血管,模擬人類早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變。
　　 2.研究OIR大鼠視網(wǎng)膜組織中p16、CyclinD1和CDK4表達的變化情況,闡明p16、CyclinD1和CDK4在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變中的作用機制及意義。
　　 3.采用具有去甲基化作用的特異性甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮胞嘧啶脫氧核苷(5-aza-CdR)進行干預(yù),研究p16基因異常甲基化對

2、新生血管異常增生的影響作用。
　　 方法：
　　 1.7日齡的健康SD大鼠隨機分為實驗組和對照組2組。實驗組高氧誘導(dǎo)建立大鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型,對照組置于正?？諝猸h(huán)境下飼養(yǎng)。實驗組和對照組分別于出生后12、14、17、21、26d處死取材。做視網(wǎng)膜鋪片ADP酶染色和HE染色觀察視網(wǎng)膜新生血管,免疫組化及免疫熒光觀察p16、CyclinD1和CDK4的表達。行western blot檢測p16、CyclinD1和CDK4

3、蛋白。Realtime PCR檢測p16、CyclinD1和CDK4的mRNA表達情況。
　　 2.7日齡SD大鼠隨機分為5-aza-CdR組和NS對照組。5-aza-CdR組幼鼠與其母鼠共同置于玻璃氧艙內(nèi)5天,持續(xù)輸入氧氣,維持氧體積分?jǐn)?shù)為(75%±2%),并于7d、9d、11d腹腔注射5-aza-CdR(0.25mg/kg)。在此高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5天后,即出生后12d回到正常室內(nèi)環(huán)境中飼養(yǎng)。NS對照組幼鼠同樣與其母鼠共同置于玻

4、璃氧艙內(nèi)5天(7-12d),于7d、9d、11d腹腔注射同體積的生理鹽水。兩組分別于17天處死取材。做視網(wǎng)膜鋪片ADP酶染色觀察視網(wǎng)膜新生血管,免疫組化觀察p16、CyclinD1和CDK4的表達。行western blot檢測p16、CyclinD1和CDK4蛋白;Realtime PCR檢測p16、CyclinD1和CDK4的mRNA表達情況。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理,采用獨立樣本

5、t檢驗進行分析,所有數(shù)據(jù)資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 一、視網(wǎng)膜新生血管的觀察:
　　 正常對照組12d時內(nèi)層毛細(xì)血管叢覆蓋在大部分視網(wǎng)膜上,僅在周邊部有小片狀的無灌注區(qū),表層血管呈放射狀;在14d時,視網(wǎng)膜血管發(fā)育進一步成熟,周邊部已沒有無灌注區(qū),全部視網(wǎng)膜被成熟的毛細(xì)血管網(wǎng)所覆蓋。17d時視網(wǎng)膜血管發(fā)育成熟。
　　 實驗組12d時視

6、網(wǎng)膜血管管徑變細(xì),分支減少,走行僵直,出現(xiàn)大片無灌注區(qū),14d時在視網(wǎng)膜灌注區(qū)和無灌注區(qū)交界的視網(wǎng)膜中周部開始出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂的新生血管;17d、21d時觀察到視網(wǎng)膜毛細(xì)血管密度增加,血管擴張、迂曲并有大量新生血管,視網(wǎng)膜新生血管的增殖達到高峰。26d時新生血管幾乎完全消退。
　　 NS對照組視網(wǎng)膜毛細(xì)血管密度增加,血管擴張、迂曲并有大量新生血管,出現(xiàn)點狀、球形的微血管瘤樣擴張,視網(wǎng)膜新生血管明顯增殖。5-aza-CdR組視網(wǎng)膜毛細(xì)

7、血管管徑細(xì),可見少量新生血管增生。
　　 對照組各時間點幼鼠的視網(wǎng)膜組織切片中,未發(fā)現(xiàn)或僅在極少數(shù)切片中偶見突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜長入玻璃體的血管內(nèi)皮細(xì)胞核。實驗組12d時突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜長入玻璃體的血管內(nèi)皮細(xì)胞核較少,14d時開始增多,17d、21dROP幼鼠視網(wǎng)膜組織明顯增厚,可見大量突破內(nèi)界膜的新生血管管腔。對照組與實驗組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 二、P16在各組表達的變化:
　　 免疫組化染色結(jié)果顯示,正常視網(wǎng)

8、膜中p16呈陽性表達。而在OIR大鼠視網(wǎng)膜,為弱陽性。14、17、21d時p16表達減弱,從陽性細(xì)胞數(shù)來看實驗組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,17d時表達缺失最明顯。26d時p16表達又略有增強。NS對照組視網(wǎng)膜p16呈弱陽性表達.而在OIR大鼠視網(wǎng)膜,5-aza-CdR組p16表達為陽性,陽性細(xì)胞數(shù)與NS對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫熒光與免疫組化結(jié)果一致,17d時對照組視網(wǎng)膜可見明顯的p16的陽性熒光信號,而實驗組可見微弱的熒

9、光信號。實驗組較對照組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層細(xì)胞核增多。
　　 Western blot檢測結(jié)果顯示:p16蛋白在OIR大鼠視網(wǎng)膜組織的表達下調(diào)。統(tǒng)計結(jié)果表明p16在正常大鼠視網(wǎng)膜組織表達量較高:OIR大鼠視網(wǎng)膜組織14d時p16的表達開始輕微下調(diào);損傷17d和21d時,P16在視網(wǎng)膜的表達顯著降低;在實驗組后26d的視網(wǎng)膜,p16的下調(diào)性表達已發(fā)生明顯回升,與7d時表達量相近。P16蛋白在NS對照組大鼠視網(wǎng)膜組織表達量較低:5-az

10、a-CdR組大鼠視網(wǎng)膜表達量較高。IDVs的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 通過Realtime-PCR技術(shù)我們檢測到,p16 mRNA在正常大鼠的視網(wǎng)膜有表達。在各時間點實驗組OIR大鼠視網(wǎng)膜,p16mRNA的表達有不同程度的下調(diào)。12d時p16 mRNA有輕微下調(diào);14d時下調(diào)明顯,尤以17d、21d下調(diào)程度最大。到26d時p16 mRNA有所回升,但仍高于對照組。P16 mRNA在5-aza-CdR組大鼠

11、的視網(wǎng)膜較低表達。在NS對照組大鼠視網(wǎng)膜,p16 mRNA表達明顯下調(diào)。兩組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 三、CyclinD1在各組表達的變化:
　　 免疫組化染色結(jié)果顯示,正常視網(wǎng)膜中CyclinD1里弱陽性表達。12d時CyclinD1表達減弱,14、17、21d時呈強陽性表達,實驗組與對照組平均灰度值相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義,17d時表達最明顯。26d時CyclinD1表達又減弱。5-aza-CdR組CyclinD1呈弱陽

12、性表達。NS對照組CyclinD1呈強陽性表達,5-aza-CdR組與NS對照組陽性細(xì)胞數(shù)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫熒光顯示CyclinD1在實驗組和對照組大鼠視網(wǎng)膜的表達部位與免疫組化結(jié)果一致。17d時對照組視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜偶見微弱的CyclinD1的陽性熒光信號,而實驗組可見較多綠色強陽性熒光信號,實驗組較對照組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層細(xì)胞核增多。
　　 各組大鼠視網(wǎng)膜CyclinD1蛋白表達的Western blot檢測結(jié)果顯示:正常

13、大鼠視網(wǎng)膜中能夠表達少量CyclinD1蛋白。在OIR大鼠視網(wǎng)膜,CyclinD1蛋白的表達隨時間變化。CyclinD1蛋白在OIR大鼠12d時表達較正常組減弱,第14d起表達開始增強。在第17d時表達水平達到高峰,明顯高于對照組。21、26d時CyclinD1蛋白表達水平有所下降,但仍高于對照組。IDVs的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示各組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。5-aza-CdR組與NS對照組大鼠視網(wǎng)膜CyclinD1蛋白表達的Westernbl

14、ot檢測結(jié)果顯示:5-aza-CdR組大鼠視網(wǎng)膜CyclinD1蛋白的表達明顯高于NS對照組,兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 CyclinD1 mRNA的Realtime-PCR結(jié)果表明,在正常大鼠視網(wǎng)膜CyclinD1 mRNA有少量表達。OIR大鼠視網(wǎng)膜CyclinD1 mRNA表達表達量隨日齡增長逐漸增加,其變化規(guī)律與蛋白表達趨勢基本一致。14d、17d、21d時CyclinD1 mRNA的表達量差異顯著,26d時Cy

15、clinD1 mRNA的表達降低,但高于對照組。在5-aza-CdR組大鼠視網(wǎng)膜CyclinD1 mRNA有少量表達。在NS對照組大鼠視網(wǎng)膜CyclinD1 mRNA表達量明顯高于5-aza-CdR組。
　　 四、CDK4在各組表達的變化:
　　 免疫組化結(jié)果顯示,實驗組不同日齡視網(wǎng)膜CDK4表達的改變:實驗組新生小鼠12d時CDK4表達減弱,自14d起視網(wǎng)膜表達CDK4蛋白水平明顯上升并超過對照組水平,至26d略有下降

16、.但仍較對照組高。NS對照組視網(wǎng)膜CDK4表達微弱.而5-aza-CdR組CDK4表達為強陽性,陽性細(xì)胞數(shù)為與NS對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 免疫熒光結(jié)果與免疫組化相符。17d時對照組視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜CDK4的陽性熒光信號較弱,而實驗組的熒光信號較強。DAPI染色顯示,實驗組較對照組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層細(xì)胞核增多。
　　 Western Blot結(jié)果顯示,正常組大鼠視網(wǎng)膜中CDK4蛋白的表達量較低,在實驗組視網(wǎng)膜CDK

17、4蛋白的表達在后14d、17d、21d顯著增加,26d時CDK4蛋白含量有所下降,但仍高于正常組,5-aza-CdR組大鼠視網(wǎng)膜中檢測到CDK4蛋白表達量較低,NS對照組CDK4蛋白表達量較高,IDVs的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 CDK4 mRNA表達結(jié)果顯示:對照組大鼠視網(wǎng)膜CDK4 mRNA有少量表達。OIR大鼠14d時CDK4 mRNA表達開始增高,14d、17d、21d增高更為明顯,26d時CDK

18、4 mRNA表達下降,但仍高于對照組水平。5-aza-CdR組大鼠視網(wǎng)膜CDK4 mRNA有少量表達。在NS對照組大鼠視網(wǎng)膜CyclinD1 mRNA表達量明顯高于5-aza-CdR組水平。
　　 結(jié)論：
　　 一、SD大鼠OIR模型與臨床早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病非常相似。可做為ROP發(fā)病機制及治療研究的動物模型。
　　 二、在OIR大鼠視網(wǎng)膜組織,p16蛋白及mRNA的表達水平降低,CyclinD1和CDK的蛋白及mRN