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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:
微小RNAs(micro RNAs,miRNAs)是一類長(zhǎng)約21~25 m的非編碼單鏈RNA分子,廣泛存在于動(dòng)植物中。它通過(guò)與靶mRNA完全或不完全的互補(bǔ)配對(duì),產(chǎn)生基因沉默、發(fā)揮負(fù)性調(diào)控基因表達(dá)的作用。研究發(fā)現(xiàn),特定的miRNA在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控及腫瘤的發(fā)生中扮演重要的角色。其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起癌基因或者抑癌基因的作用,為胃癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的工具。但迄今為止,真正確認(rèn)功能的mi
2、RNA還微乎其微,而且其發(fā)揮作用的具體機(jī)制也有待進(jìn)一步的研究以明確。已有報(bào)道,與胃遠(yuǎn)端腺癌相比,賁門腺癌不僅位置獨(dú)特,發(fā)病機(jī)制也存在不同。
目的:
篩選胃遠(yuǎn)端腺癌中差異表達(dá)的miRNAs,觀察其與臨床病理因素的關(guān)系,并就其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制進(jìn)行初步的研究。
方法:
1.取我科實(shí)驗(yàn)室液氮凍存的胃遠(yuǎn)端腺癌及配對(duì)正常組織進(jìn)行HE染色,確認(rèn)病理情況;采用Aglent人miRN
3、A寡核苷酸基因芯片,對(duì)3對(duì)胃遠(yuǎn)端(體、竇)腺癌組織及配對(duì)正常組織進(jìn)行檢測(cè),篩選胃遠(yuǎn)端腺癌差異表達(dá)的miRNAs。
2.選擇特定miRNAs,在20例胃遠(yuǎn)端腺癌及配對(duì)正常組織中用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證,并觀察其與患者年齡、腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素的關(guān)系;在得到確認(rèn)差異表達(dá)的miRNAs后,同法觀察其在17例賁門腺癌與胃遠(yuǎn)端腺癌之間表達(dá)是否存在差異、胃腺癌患者血清中的表達(dá)狀況、人胃粘膜細(xì)胞系與人胃癌細(xì)胞系的
4、表達(dá)狀況。
3.選擇特定miRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞系,運(yùn)用MTS法、流式細(xì)胞術(shù)觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。
4.運(yùn)用TargetScan等生物信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)特定miRNA可能的靶基因。
結(jié)果:
1.通過(guò)對(duì)液氮凍存胃遠(yuǎn)端腺癌及配對(duì)正常組織的HE染色,確認(rèn)了各自的病理狀況;miRNAs芯片檢測(cè),發(fā)現(xiàn)共47條miRNAs在胃遠(yuǎn)端腺癌組織和配對(duì)正常組織中表達(dá)差異顯著,上調(diào)的24條,下
5、調(diào)的23條;在這些差異表達(dá)的miRNAs中,miR-204、miR-196b、miR-101、miR-107等27條首次報(bào)道于胃遠(yuǎn)端腺癌中;
2.選擇3個(gè)高表達(dá)miRNAs:miR-18b、miR-93、miR-196b和2個(gè)低表達(dá)的miRNAs:miR-204、miR-375進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析,顯示在胃遠(yuǎn)端腺癌患者樣本中,miR-196b、miR-204、miR-375的表達(dá)情況與芯片一致,但其與患者年齡、癌栓有
6、無(wú)、腫瘤直徑,分化程度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均沒(méi)有關(guān)聯(lián);同時(shí),miR-204水平在胃腺癌患者血清中顯著升高,ROC曲線分析顯示,血清miR-204水平對(duì)胃腺癌患者和健康對(duì)照的鑒別效能為0.844(95%CI:0.579-0.973,p=0.002),敏感性和特異性分別為100%和75%,最佳cut-off值為0.0343(2-△Ct,相對(duì)于U6 snRNA);在賁門腺癌和胃遠(yuǎn)端腺癌中,miR-375表達(dá)均下調(diào),而胃遠(yuǎn)端腺癌下調(diào)的更明顯,
7、兩者有顯著性差異。
3.轉(zhuǎn)染成熟miR-204 mimics于人胃癌細(xì)胞系MGC-803、BGC-823、SGC-7901,發(fā)現(xiàn)不論是不同轉(zhuǎn)染濃度,抑或是不同時(shí)間點(diǎn),對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡沒(méi)有明顯的影響。
4.生物信息學(xué)顯示BCL-2,NR3C1,SOCS6等可能為miR-204的靶基因。
結(jié)論:
1.胃遠(yuǎn)端腺癌有其獨(dú)特的miRNA表達(dá)譜;
2.驗(yàn)證的差異表達(dá)miRN
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