miR-193b在胰腺癌中表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、研究背景:
　　胰腺癌(PC)是最致命的惡性腫瘤之一，居全世界癌癥相關(guān)死亡原因第8位。胰腺癌預(yù)后差的主要原因是早期缺乏特異性臨床癥狀、無(wú)有效的早期診斷標(biāo)志物、早期轉(zhuǎn)移及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的放化療效果差。胰腺癌發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前尚不十分明確，尋找新的診斷治療靶點(diǎn)是胰腺癌研究的重點(diǎn)。
　　microRNA是一類新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非蛋白編碼的單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度為19-24nt，它能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)或翻譯，廣泛地參與細(xì)胞增殖、分化

2、、凋亡和代謝等重要的生物學(xué)過程。大量文獻(xiàn)表明microRNA可作為癌基因或者抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此深入研究miRNA在人體腫瘤中的表達(dá)及其功能，對(duì)探索腫瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，并將有利于對(duì)腫瘤的診斷、治療及預(yù)后的判斷。miR-193b由位于16p13.12上的基因所編碼，目前已有不少研究報(bào)道m(xù)iR-193b在多種人類惡性腫瘤中的表達(dá)失調(diào)并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如宮頸腫瘤、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、急性淋巴細(xì)胞白血病等，提

3、示miR-193b可能在人類惡性腫瘤中發(fā)揮著重要的作用。Ikeda Y等研究發(fā)現(xiàn)miR-193b是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路相關(guān)miRNA，外源性過表達(dá)miR-193b能抑制培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞的增殖，表明miR-193b可能參與了PC發(fā)生發(fā)展并扮演著重要作用。然而，目前關(guān)于miR-193b在人胰腺癌組織中的表達(dá)及生物學(xué)作用機(jī)制尚不明確。
　　目的:
　　檢測(cè)人胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞系中miR-193b和STMN1的表

4、達(dá)的情況，分析二者在胰腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性和STMN1蛋白表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理因素及根治性胰腺癌術(shù)后患者預(yù)后之間的關(guān)系;探討miR-193b和STMN1(癌蛋白18)在胰腺癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)功能機(jī)制并驗(yàn)證miR-193b對(duì)STMN1的靶向調(diào)節(jié)作用。
　　方法:
　　1.收集新鮮胰腺癌組織及與其配對(duì)的癌旁組織、胰腺癌細(xì)胞系并收集胰腺癌石蠟切片及正常胰腺組織。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)m

5、iR-193b、STMN1 mRNA在胰腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)，分析兩者在胰腺癌組織中表達(dá)相關(guān)性;Western blot檢測(cè)STMN1蛋白在人胰腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá);免疫組化檢測(cè)STMN1蛋白在胰腺癌中表達(dá)情況，分析STMN1蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理因素及根治性胰腺癌術(shù)后患者預(yù)后之間的關(guān)系。
　　2.將hsa-miR-193b mimic使用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染入Panc-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和空

6、白對(duì)照組。Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染hsa-miR-193b mimic后Panc-1細(xì)胞中miR-193b表達(dá)情況。分別運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell法檢測(cè)表達(dá)上調(diào)miR-193b后對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。用western blot方法檢測(cè)上調(diào)miR-193b后STMN1蛋白表達(dá)水平。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證STMN1是miR-193b的下游直接靶基因。
　　3.購(gòu)買針對(duì)STMN1的特異性si

7、RNA，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot檢測(cè)STMN1-siRNA對(duì)STMN1表達(dá)的影響;分別運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell法檢測(cè)沉默STMN1表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染STMN1-siRNA后Panc-1細(xì)胞中α微管蛋白及乙酰化α微

8、管蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.miR-193b在人胰腺癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁胰腺組織及正常胰腺組織，miR-193b在TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期的胰腺癌組織中表達(dá)較Ⅰ期和Ⅱ期的胰腺癌組織中表達(dá)明顯低。同時(shí)miR-193b在人胰腺癌細(xì)胞系中表達(dá)較正常胰腺組織明顯低。
　　2.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)STMN1為miR-193b潛在下游直接靶基因。
　　3.STMN1 mRNA和蛋白在胰腺癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織;

9、STMN1 mRNA和蛋白在胰腺癌細(xì)胞系中表達(dá)明顯高于正常胰腺組織。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示STMN1蛋白在胰腺癌中高表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞漿中，而在正常胰腺組織中主要為陰性表達(dá);STMN1蛋白表達(dá)水平與胰腺癌的病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān);STMN1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組根治性胰腺導(dǎo)管腺癌患者的生存率明顯低于陰性表達(dá)組;單、多因素分析顯示STMN1是根治性胰腺癌術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　5.人胰腺癌組織中miR-1

10、93b和STMN1 mRNA表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)。
　　6.通過轉(zhuǎn)染miR-193b mimic成功上調(diào)了Panc-1細(xì)胞內(nèi)miR-193b表達(dá)水平，miR-193b能明顯下調(diào)STMN1蛋白的表達(dá)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)STMN1是miR-193b下游直接靶基因。
　　7.上調(diào)Panc-1細(xì)胞內(nèi)miR-193b表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　8.通過轉(zhuǎn)染STMN1-siRNA沉默Panc-1

11、細(xì)胞中STMN1表達(dá)，Real-time PCR和Western blot顯示STMN1-siRNA可抑制STMN1表達(dá)，沉默Panc-1細(xì)胞內(nèi)STMN1表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡;沉默STMN1表達(dá)上調(diào)了Panc-1細(xì)胞中乙?；廖⒐艿鞍椎谋磉_(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　1.miR-193b在胰腺癌組織及細(xì)胞系中均低表達(dá)。
　　2.STMN1在胰腺癌組織及細(xì)胞系中均高表達(dá)，STMN1蛋白表達(dá)與病

12、理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及根治性胰腺癌術(shù)后患者差的預(yù)后明顯相關(guān)，STMN1是根治性胰腺癌術(shù)后患者獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　3.胰腺癌組織中miR-193b與STMN1 mRNA表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)。
　　4.miR-193b能直接靶向下調(diào)STMN1蛋白表達(dá)并抑制Panc-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　5.STMN1能下調(diào)Panc-1細(xì)胞中α-微管蛋白乙?；剑龠M(jìn)微管解聚，同時(shí)促進(jìn)Panc-1細(xì)胞增殖、