癌基因MTDH在胰腺癌中的表達(dá)及其功能的研究.pdf

1、胰腺癌是一種起病隱匿，早期診斷困難，惡性程度高，手術(shù)切除率低，放化療不敏感的消化系統(tǒng)腫瘤，占惡性腫瘤的1％-2％。在美國(guó)，胰腺癌排名惡性腫瘤死因的第4位。2011年，美國(guó)胰腺癌新發(fā)病例數(shù)為44030例，死亡37660例，5年生存率僅有6％。胰腺癌的發(fā)病率存在明顯的地域差異，經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)和工業(yè)化程度高的地區(qū)發(fā)病率也高。隨著近年來(lái)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，污染的加重，生活習(xí)慣的改變，中國(guó)胰腺癌的發(fā)病率也逐年上升。據(jù)上海市流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2008年上海市胰腺

2、癌發(fā)病率已上升至男性7.26/10萬(wàn)，女性4.95/10萬(wàn)。
　　由于缺乏特異性的癥狀和體征，胰腺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已經(jīng)到了中晚期，失去了最佳治療的時(shí)機(jī)。雖然采取了積極的治療方法，如手術(shù)、化療、放療等，但是胰腺癌的預(yù)后并沒(méi)有得到明顯改善。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中伴隨著癌基因及其受體的活化以及抑癌基因的失活和丟失。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的不斷發(fā)展，對(duì)胰腺癌生物學(xué)特性和相關(guān)機(jī)制研究的不斷深入，基于干預(yù)胰腺癌相關(guān)基因異常變化的分子靶向治療給胰腺癌的治療帶

3、來(lái)了曙光。如果將分子靶向治療和傳統(tǒng)治療方式聯(lián)合很有可能會(huì)改善胰腺癌的預(yù)后，提高胰腺癌患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間。
　　異粘蛋白(metadherin，MTDH)又稱AEG-1、LYRIC或3D3，位于人類8號(hào)染色體(8q22)，包含11個(gè)內(nèi)含子和12個(gè)外顯子，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)癌基因，其所在區(qū)域被認(rèn)為和多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。MTDH已被證實(shí)在人體絕大部分組織器官均有不同程度的表達(dá)，并且在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，其表達(dá)高

4、低被認(rèn)為和多種惡性腫瘤的分化、TNM分期及預(yù)后相關(guān)。目前的研究表明MTDH可以通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt、NF-κB、Wnt/β-catenin、MAPK等多條信號(hào)通路而影響腫瘤的發(fā)生、增殖、抗凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥、自噬等多個(gè)環(huán)節(jié)。MTDH很可能作為一個(gè)廣譜性的標(biāo)志物，在惡性腫瘤的診斷、治療及預(yù)測(cè)預(yù)后中發(fā)揮巨大作用。
　　目前國(guó)內(nèi)外尚未有MTDH與胰腺癌發(fā)病的相關(guān)報(bào)道。在本課題中，我們首先通過(guò)高通量組織芯片免疫組織化學(xué)技

5、術(shù)分析了MTDH在胰腺癌和配對(duì)癌旁組織的表達(dá)模式，以及MTDH在癌組織中表達(dá)高低與患者臨床病理特征的關(guān)系和潛在預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值，證實(shí)MTDH評(píng)分和吸煙、分化、淋巴轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，并且是胰腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素。其次，我們檢測(cè)了MTDH在不同胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異，選取高表達(dá)MTDH的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和SW1990為研究對(duì)象，采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建MTDH的RNAi慢病毒載體，并獲得了穩(wěn)定干擾MTDH表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株。最后，

6、我們通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究抑制MTDH表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞的增殖凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，證實(shí)了干擾胰腺癌中MTDH的表達(dá)，可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MTDH可以通過(guò)Akt/mTor通路的影響胰腺癌的生物學(xué)行為。MTDH作為胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素以及潛在治療靶點(diǎn)，值得我們進(jìn)一步研究。
　　第一部分 MTDH在胰腺癌臨床組織中的表達(dá)及其預(yù)后意義
　　目的:研究胰腺癌中MTDH在癌組織和癌

7、旁組織中的表達(dá)差異，分析MTDH與胰腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:通過(guò)組織芯片免疫組化染色檢測(cè)89對(duì)胰腺癌及配對(duì)癌旁組織的MTDH蛋白水平的表達(dá)情況。使用秩和檢驗(yàn)分析MTDH染色評(píng)分和吸煙、CA19-9高低、TNM分期、生存時(shí)間等臨床病理資料的相關(guān)性，累計(jì)生存時(shí)間和累計(jì)生存率采用Kaplan-Meier法，生存檢驗(yàn)采用Log-rank法，采取Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素分析。
　　結(jié)果:組織芯片免疫組

8、化結(jié)果提示，MTDH蛋白在胰腺癌組織的表達(dá)水平要高于配對(duì)癌旁組織（高表達(dá)率:癌58/89，65.2％;癌旁23/89，25.8％），在胰腺癌組織中MTDH蛋白表達(dá)主要在胰腺癌細(xì)胞漿，尤其在核周表達(dá)較明顯，而在癌旁正常導(dǎo)管中，MTDH染色較淺，且一般為均勻分布于細(xì)胞漿中。胰腺癌組織MTDH蛋白高表達(dá)（染色指數(shù)＞6）與生存時(shí)間短（P=0.000），吸煙（P=0.029），腫瘤細(xì)胞分化差（P=0.014），淋巴轉(zhuǎn)移(P=0.012)，TNM分

9、期晚（P=0.036）相關(guān)。Kaplan-Meier法分析MTDH評(píng)分高低（P=0.000）、腫瘤分化高低（P=0.002）、TNM分期早晚（P=0.036），CA19-9高低（P=0.048）的患者生存時(shí)間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步行Cox回歸多因素分析提示MTDH是胰腺癌患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=2.638,95％ CI=1.537-4.528,P=0.000）。
　　結(jié)論:在人胰腺癌中MTDH蛋白普遍較癌旁組織異常高

10、表達(dá)，主要表達(dá)在胞漿尤其是核周。MTDH的高表達(dá)與的臨床病理因素（分化差、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期晚）顯著相關(guān)，并且與胰腺癌公認(rèn)的發(fā)病高危因素（吸煙）相關(guān)。MTDH染色評(píng)分與患者的預(yù)后密切相關(guān)，是胰腺癌患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　第二部分 MTDH基因特異性shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組載體胰腺癌細(xì)胞的建立
　　目的:構(gòu)建MTDH基因特異性shRNA真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定干擾MTDH表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞，用于M

11、TDH對(duì)胰腺癌生物學(xué)特性影響的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)和機(jī)制的研究。
　　方法:Western blot檢測(cè)人胰腺癌細(xì)胞系中MTDH的表達(dá)，選擇高表達(dá)MTDH的細(xì)胞系為后續(xù)研究對(duì)象。設(shè)計(jì)合成MTDH基因特異性的shRNA序列，以慢病毒載體pLKO.1 TRC cloning vector為基礎(chǔ)構(gòu)建MTDH基因特異性shRNA重組真核表達(dá)載體。包裝生成相應(yīng)慢病毒并轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)重組載體的胰腺癌細(xì)胞系。采用PCR技術(shù)和We

12、stern Blot技術(shù)驗(yàn)證和篩選MTDH基因抑制效應(yīng)最為顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示在6株胰腺癌細(xì)胞系中PANC-1和SW1990中MTDH蛋白含量最高。設(shè)計(jì)合成的MTDH基因特異性shRNA單鏈成功退火形成雙鏈shRNA。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，雙鏈shRNA插入真核表達(dá)載體位置正確。用重組質(zhì)粒包裝慢病毒并成功轉(zhuǎn)染PANC-1和SW1990細(xì)胞，采用嘌呤霉素成功篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒的胰腺癌細(xì)

13、胞株。經(jīng)PCR和Western blot驗(yàn)證和篩選，選擇MTDH基因抑制效果最為顯著的PANC-shMTDH2和SW1990-shMTDH2為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了MTDH基因特異性shRNA真核表達(dá)載體，建立了穩(wěn)定干擾MTDH表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞。PCR和Western blot結(jié)果顯示PANC-shMTDH2和SW1990-shMTDH2為MTDH下調(diào)最明顯的細(xì)胞株。為后續(xù)研究MTDH對(duì)胰腺癌生物學(xué)特性影響的體內(nèi)

14、體外實(shí)驗(yàn)和機(jī)制的研究打下了基礎(chǔ)。
　　第三部分干擾MTDH表達(dá)對(duì)胰腺癌惡性潛能的影響及分子機(jī)制研究
　　目的:研究干擾MTDH對(duì)于胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和SW1990體外增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲能力的影響;研究干擾MTDH對(duì)于裸鼠SW1990皮下瘤生長(zhǎng)的影響;初步探索胰腺癌中干擾MTDH后增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)的變化及對(duì)Akt/mTor通路的影響。
　　方法:通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，PI染色法分析細(xì)胞周期，A

15、nnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞增殖和群體依賴性變化，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移能力，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。通過(guò)裸鼠皮下瘤模型研究干擾MTDH對(duì)SW1990皮下成瘤的影響。利用Westernblot檢測(cè)Ki67，Cyctin D1，E-cadherin，MMP-9及Akt/mTor通路關(guān)鍵分子的變化，探索胰腺癌中干擾MTDH對(duì)Akt/mTor通路的影響。
　　結(jié)果:CC

16、K-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)提示，下調(diào)MTDH表達(dá)水平后，不同時(shí)間點(diǎn)的PANC-1和SW1990細(xì)胞系的增殖能力明顯減弱。細(xì)胞周期分析提示:干擾MTDH后，人胰腺癌細(xì)胞PANC-1和SW1990均出現(xiàn)G1增多，G2和S期減少，發(fā)生G1期阻滯。檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，減少M(fèi)TDH表達(dá)后，PANC-1和SW1990發(fā)生晚期凋亡和發(fā)生早期凋亡均較對(duì)照組明顯增多。平板克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)MTDH表達(dá)的下調(diào)明顯抑制了PANC-1和SW1990的增殖以及增加了其群體依賴性

17、。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)MTDH表達(dá)減少后PANC-1和SW1990遷移能力明顯減弱。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)提示PANC-1和SW1990干擾MTDH后，穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少。SW1990體外皮下瘤模型提示與對(duì)照組相比，RNAi組腫瘤的重量和體積均較小，且組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blot檢測(cè)干擾MTDH后Ki67，Cyclin D1，MMP-9表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Akt/mTo

18、r通路中的關(guān)鍵分子顯著變化，提示胰腺癌中MTDH可以通過(guò)調(diào)控Akt/mTor通路影響胰腺癌的生物學(xué)行為。
　　結(jié)論:以MTDH為靶點(diǎn)的RNAi可以有效抑制人胰腺癌細(xì)胞PANC-1和SW1990的增殖、侵襲和遷移，造成G1期阻滯，并增加細(xì)胞凋亡，有效改善胰腺癌細(xì)胞的惡性表型。進(jìn)一步的機(jī)制探索表明MTDH RNAi可以下調(diào)Ki67，Cyclin D1，MMP-9的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，并可通過(guò)調(diào)控Akt/mTOR通路抑