EGR3在胰腺癌中的功能和機(jī)制研究.pdf

1、目的：胰腺癌是一種高度侵襲性的惡性腫瘤，患者的預(yù)后往往不佳。早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子3（early growth response3, EGR3）作為EGR轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，參與多種生物過(guò)程的調(diào)節(jié)，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，炎癥反應(yīng)和免疫。目前，EGR3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不確定。本研究旨在探討EGR3對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的影響及機(jī)制，從而為胰

2、腺癌的治療提供新的思路。
　　方法：⑴EGR3對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究：首先，分別利用siRNA或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)在基因和蛋白水平檢測(cè)兩者的轉(zhuǎn)染效率，篩選能夠成功下調(diào)或上調(diào)細(xì)胞內(nèi)EGR3水平的siRNA或質(zhì)粒；其次，分別應(yīng)用CCK8（CCK8 assay）和平板克隆實(shí)驗(yàn)（colony formation assay）檢測(cè)沉默或過(guò)表達(dá)

3、EGR3的胰腺癌細(xì)胞的增殖能力；最后，分析EGR3影響細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。⑵EGR3對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究：在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們首先分別利用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FCM）和TUNEL實(shí)驗(yàn)（TUNEL assay）檢測(cè)EGR3對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響；再者，分別進(jìn)行qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的變化情況。⑶EGR3在胰腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程中的作用及機(jī)制研究：首先，我們應(yīng)用沉默或過(guò)

4、表達(dá)EGR3的胰腺癌細(xì)胞，觀察其形態(tài)學(xué)的改變，利用劃痕實(shí)驗(yàn)（wound healing assay）、Transwell實(shí)驗(yàn)（Transwell assay）檢測(cè)EGR3對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響；其次，分別利用qRT-PCR、Western blot和免疫熒光（immunofluorescence）技術(shù)檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，以及關(guān)鍵信號(hào)通路活性的變化。⑷EGR3抑制Akt Ser473位點(diǎn)磷酸化的機(jī)制研究：在本部分實(shí)驗(yàn)中，

5、我們分別應(yīng)用PI3K抑制劑 LY294002和 Akt抑制劑 MK-2206預(yù)處理胰腺癌細(xì)胞，隨后沉默細(xì)胞內(nèi)的EGR3，利用 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；然后，利用 Western blot技術(shù)檢測(cè)LY294002或MK-2206預(yù)處理后再轉(zhuǎn)染EGR3 siRNA的胰腺癌細(xì)胞內(nèi)的Akt Ser473位點(diǎn)的磷酸化水平；最后，我們進(jìn)行qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分析EGR3對(duì)mTOR復(fù)合物2（mTORC2）的重要組分Ri

6、ctor的影響。
　　結(jié)果：①EGR3抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖：qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種EGR3 siRNA（si-EGR3-1和si-EGR3-3）均能夠明顯下調(diào)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1及SW1990內(nèi)的EGR3表達(dá)，而EGR3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（EGR3-plasmid）則成功上調(diào)EGR3水平；CCK8實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默EGR3使PANC-1及SW1990細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，而過(guò)表達(dá)EGR

7、3則使這兩種細(xì)胞的增殖能力減弱；Western blot實(shí)驗(yàn)提示EGR3 siRNA轉(zhuǎn)染后的PANC-1及SW1990細(xì)胞內(nèi)的Ser473位點(diǎn)磷酸化的Akt（pAkt-Ser473）水平及其下游靶蛋白P70S6K的磷酸化水平（p-P70S6K）升高，而上調(diào)EGR3后細(xì)胞內(nèi)的pAkt-Ser473和p-P70S6K均降低。②EGR3誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡：流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默EGR3的PANC-1細(xì)胞的凋亡率下降，過(guò)表達(dá)

8、EGR3的PANC-1細(xì)胞的凋亡率則升高；qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分別在mRNA和蛋白水平證實(shí)，沉默EGR3的PANC-1細(xì)胞內(nèi)的促凋亡因子Bax和抑凋亡因子Bcl2分別降低和上升，而上調(diào)PANC-1細(xì)胞內(nèi)的EGR3后這兩種凋亡相關(guān)蛋白則分別升高和降低。③EGR3減弱胰腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，抑制細(xì)胞的EMT：用EGR3 siRNA轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，在顯微鏡下觀察 PANC-1細(xì)胞形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)對(duì)照（si-NC

9、）組的PANC-1細(xì)胞形狀為多邊形，排列整齊，細(xì)胞間連接緊密，而EGR3 siRNA組的PANC-1細(xì)胞形狀則變得不規(guī)則，排列雜亂，細(xì)胞間隙變大；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)PANC-1細(xì)胞內(nèi)的EGR3水平下降時(shí)，劃痕愈合加快，而EGR3上升時(shí)劃痕愈合速度則減慢；通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)PANC-1細(xì)胞內(nèi)的EGR3水平會(huì)引起侵襲及遷移的細(xì)胞數(shù)增多，而上調(diào) EGR3則導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)減少；在mRNA和蛋白水平檢測(cè)PANC-1細(xì)胞內(nèi)的Sl

10、ug、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)的EGR3后，E-cadherin降低而Slug和Vimentin上升，當(dāng)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的EGR3則導(dǎo)致相反的效果；免疫熒光結(jié)果表明，PANC-1和SW1990細(xì)胞表面的E-cadherin蛋白表達(dá)隨著EGR3的降低而降低，上升而增加；Western blot結(jié)果顯示，PANC-1細(xì)胞內(nèi)的EGR3沉默后，pAkt-Ser473和pGSK3β-Ser9的水平均升高，而EGR

11、3過(guò)表達(dá)時(shí)兩者均下降。④EGR3降低Akt Ser473位點(diǎn)磷酸化水平的作用可能與其抑制Rictor的表達(dá)有關(guān)：向經(jīng)過(guò)LY294002預(yù)處理過(guò)的PANC-1和SW1990細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染EGR3 siRNA后，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGR3 siRNA組的細(xì)胞增殖能力仍高于si-NC組，而沉默經(jīng)過(guò)MK-2206預(yù)處理過(guò)的PANC-1及SW1990細(xì)胞內(nèi)的EGR3則導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力低于si-NC組；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LY29

12、4002預(yù)處理后再轉(zhuǎn)染EGR3 siRNA的PANC-1和SW1990細(xì)胞內(nèi)的pAkt-Ser473和p-P70S6K的水平與si-NC組的相比仍增加，而利用MK-2206預(yù)處理細(xì)胞后，沉默兩種細(xì)胞內(nèi)的EGR3則導(dǎo)致pAkt-Ser473的變化不明顯，同時(shí)引起p-P70S6K的水平降低；qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)PANC-1和SW1990細(xì)胞內(nèi)的EGR3降低時(shí)mTORC2的核心亞基Rictor的表達(dá)水平升高，而E

13、GR3上調(diào)時(shí)Rictor則減少。
　　結(jié)論：EGR3分別通過(guò)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、減弱細(xì)胞侵襲遷移能力和EMT這三個(gè)方面發(fā)揮抑癌作用，其可能與抑制Akt/P70S6K通路，促進(jìn)促凋亡因子Bax同時(shí)降低抗凋亡因子Bcl2的表達(dá)，并且減弱Akt/GSK3β信號(hào)通路活性從而影響下游EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin和轉(zhuǎn)錄因子Slug的表達(dá)有關(guān)。除此之外， EGR3對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抗增殖作用與Akt有關(guān)，但不