miRNA-424-5p在胰腺癌中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　胰腺癌是消化系統(tǒng)比較常見的惡性腫瘤之一，已經(jīng)成為美國癌癥相關(guān)死亡原因的第四位。大多數(shù)患者在胰腺癌診斷后的12個(gè)月后死亡，診斷后能夠存活5年者極少。胰腺癌預(yù)后差，歸因于臨床癥狀出現(xiàn)較晚，早期局部侵犯和高度轉(zhuǎn)移潛能，大多數(shù)患者一經(jīng)診斷即失去手術(shù)機(jī)會(huì)，而胰腺癌患者能夠獲得較長生存率的唯一的機(jī)會(huì)便是能夠進(jìn)行根治性手術(shù)切除。胰腺癌被認(rèn)為是一個(gè)復(fù)雜的與多種基因有關(guān)的疾病。迄今為止，多條信號通路與眾多的生長因子、癌基因和抑癌基因

2、等的異常表達(dá)或激活參與了胰腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程。因此探索胰腺癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的診斷生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)是提高治療效果的關(guān)鍵。
　　MicroRNA（miRNA）是近些年來被發(fā)現(xiàn)的一類非編碼單鏈小RNA分子，其參與了眾多的生物學(xué)過程，例如生長、增殖、分化和凋亡等過程。miRNA通過與它們的靶向mRNA的3'UTR區(qū)以堿基互補(bǔ)配對的方式結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或抑制其翻譯，通過這種機(jī)制miRNA降低了靶基因蛋白的表達(dá)水平。miRNA

3、的這種負(fù)性調(diào)節(jié)與多種人類腫瘤密切相關(guān)，比如胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等。因此深入研究miRNA在人體腫瘤中的表達(dá)及其功能，對探索腫瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，并將有利于對腫瘤的診斷、治療及預(yù)后的判斷。ERK1/2信號通路已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)因素的研究熱點(diǎn)。研究表明ERK1/2可參與多種生物學(xué)反應(yīng)包括細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞凋亡等。然而ERK1/2在胰腺癌中的作用卻知之甚少。
　　目的:

4、r>　　檢測miR-424-5p在胰腺癌中的表達(dá)的情況，探討miR-424-5p在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的相關(guān)功能機(jī)制，分析miR-424-5p的靶基因SOCS6與胰腺癌臨床病理因素的關(guān)系，同時(shí)研究miR-424-5p對ERK1/2信號通路的影響。
　　方法:
　　1.收集2009年9月-2012年9月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院手術(shù)切除的胰腺癌組織新鮮標(biāo)本及其癌旁組織各30例，正常胰腺組織標(biāo)本10例作為對照組。采用實(shí)時(shí)熒光定量

5、real-time PCR方法檢測miR-424-5p在胰腺癌、癌旁及正常胰腺組織中的表達(dá)情況。同時(shí)用real-time PCR和western blot方法檢測SOCS6的表達(dá)情況。分析miR-424-5p與SOCS6的表達(dá)之間的關(guān)系及SOCS6與胰腺癌患者臨床病理關(guān)系。
　　2.選取四個(gè)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、PC-2、SW1990、CFPAC-1用real-time PCR方法檢測miR-424-5p的表達(dá)差異。選取miR

6、-424-5p高表達(dá)的細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。將hsa-miR-424-5p inhibitor使用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染入PANC-1細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置陰性對照組和空白對照組。Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-424-5p的表達(dá)情況。同時(shí)用real-time PCR和western blot方法檢測下游靶點(diǎn)SOCS6的表達(dá)水平。MTT法檢測細(xì)胞的增殖并繪制生長曲線;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期;Trans

7、well法檢測細(xì)胞遷移和侵襲的能力。
　　3.運(yùn)用生物信息學(xué)(miRbase， TargetScan， miRanda)的方法，預(yù)測SOCS6為其可能的下游靶點(diǎn)并用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證。
　　4.選取PANC-1細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染miR-424-5p inhibitor及miR-424-5p inhibitor陰性對照組后，利用western blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)觀察ERK1/2蛋白在PANC-1細(xì)胞中的表達(dá)變化;實(shí)時(shí)熒光定

8、量PCR檢測ERK1/2信號通路下游Bcl-2，Mcl-1的變化情況，探討miR-424-5p對胰腺癌細(xì)胞ERK1/2信號通路的影響。
　　結(jié)果:
　　1.用real-time PCR檢測胰腺癌組織中miR-424-5p相對表達(dá)量為0.07407±0.03385，明顯高于癌旁組織的0.04601±0.03143和正常胰腺組織中的0.02792±0.01801(P＜0.05)。而SOCS6的表達(dá)狀態(tài)卻與miR-424-5p相反

9、。SOCS6在胰腺癌中的相對表達(dá)量為0.00752±0.00123，低于癌旁組織0.00883±0.00227和正常胰腺組織0.01102±0.00108(P＜0.05)。利用spearman雙變量相關(guān)分析miR-424-5p的表達(dá)情況與SOCS6表達(dá)的關(guān)系，我們得出miR-424-5p的表達(dá)情況與SOCS6表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(R=-0.455， P=0.026)。miR-424-5p和SOCS6與患者的性別，年齡，吸煙與否，腫瘤部位，腫瘤大

10、小無明顯相關(guān)性，而與腫瘤分化程度，TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測到miR-424-5p在胰腺癌細(xì)胞系PANC-1中表達(dá)最高，故選取PANC-1作為下一步實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系。PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-424-5p inhibitor后real-time PCR檢測證實(shí)miR-424-5p被成功抑制。MTT法檢測細(xì)胞增殖顯示miR-424-5p抑制后24-72小時(shí)活細(xì)胞數(shù)量明顯低于對照組(P＜0.05)。

11、流式細(xì)胞技術(shù)檢測到抑制miR-424-5p后，凋亡細(xì)胞的比例增加至18.03％±2.95％，但是對細(xì)胞周期無明顯影響。抑制miR-424-5p的表達(dá)后，PANC-1細(xì)胞遷移能力約為陰性對照組的40％，侵襲能力約為陰性對照組的50％，兩者都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.通過生物信息學(xué)方法結(jié)合miR-424-5p的生物學(xué)特性，SOCS6為miR-424-5p的可能靶蛋白之一，利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)加以驗(yàn)證，分析結(jié)果顯示，

12、SOCS6是miR-424-5p的直接作用靶基因，并且作用位點(diǎn)位于302-308處。
　　4.PANC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-424-5p inhibitor后，實(shí)驗(yàn)組SOCS6mRNA的相對表達(dá)量較對照組增加了30％左右;Bcl-2和Mcl-1mRNA的表達(dá)均出現(xiàn)一定程度的下降，約25％左右。Westernblot結(jié)果顯示miR-424-5p inhibitor組的ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。提示miR-424-5p是通過E

13、RK1/2信號通路起作用的。
　　結(jié)論:
　　1.miR-424-5p在胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)。miR-424-5p的表達(dá)與胰腺癌患者的性別，年齡，吸煙與否，腫瘤部位，腫瘤大小無明顯相關(guān)性，而與腫瘤分化程度，TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2.miR-424-5p表達(dá)受到抑制后，PANC-1細(xì)胞增殖減慢、侵襲遷移能力降低、凋亡細(xì)胞數(shù)增多，miR-424-5p可能成為胰腺癌基因治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)用生物信息學(xué)方