β-NGF及受體在胰腺癌嗜神經(jīng)性中的分子機制研究.pdf

1、目的：從胰腺癌手術(shù)切除標(biāo)本、體外細胞培養(yǎng)、動物模型三個層次探討β-NGF、TrKA、P75NGFR在胰腺癌神經(jīng)轉(zhuǎn)移中的作用機制，著重研究體外胰腺癌MIAPaca-2細胞趨化、侵襲等生物學(xué)特性的變化；離體癌細胞、在體腫瘤組織、神經(jīng)組織中，β-NGF-NGFR生物軸系統(tǒng)表達的組織細胞特異性，且彼此之間可能的相互協(xié)同作用。從而探索β-NGF在神經(jīng)浸潤中所起作用和可能的分子機制，為闡明胰腺癌嗜神經(jīng)性發(fā)病機制提供理論基礎(chǔ)、為將來尋找可能的作用靶點

2、提供參考。 方法：采用免疫組化法檢測胰腺癌組織中β-NGF、TrKA、P75NGFR、E-cadherin、MMP-2各指標(biāo)的表達、分布特點，并分析與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。體外培養(yǎng)未分化人胰腺癌MIAPaca-2細胞，應(yīng)用掃描和透射電鏡觀察β-NGF作用后癌細胞表面和內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化。MTT和FCM檢測外源性β-NGF、TrKA特異性拮抗劑K252a對MIAPaca-2增殖的影響。酶標(biāo)儀觀察β-NGF對癌細胞黏附能力影響。

3、劃痕/過河實驗與Transwell侵襲小室觀察β-NGF對MIAPaca-2細胞運動、趨化和侵襲能力的影響。Matrigel/癌細胞共培養(yǎng)72h后，Masson染色觀察癌細胞周圍人工基質(zhì)被融解情況。建立裸小鼠胰腺癌皮下和原位移植瘤動物模型，用HE和硝酸銀染色檢測體內(nèi)神經(jīng)纖維的侵襲情況。電鏡觀察受侵襲神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的破壞情況。RT-PCR、RealtimeRT-PCR、Westernbolt方法檢測在裸鼠體內(nèi)胰腺癌細胞中β-NGF、Tr

4、KA、P75NGFRmRNA、蛋白的表達。 結(jié)果：手術(shù)標(biāo)本：β-NGF、TrkA、P75NGFR、E-cadherin及MMP-2均參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。胰腺癌神經(jīng)浸潤幾率為56.25％(45/80)。β-NGF、TrkA可能與胰腺癌細胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。β-NGF與TrKA、MMP-2表達均呈正相關(guān)，與E-cad呈負相關(guān)，而與P75NGFR無相關(guān)性。體外細胞實驗：人胰腺癌細胞系MIAPaca-2

5、為未分化細胞，易于貼壁生長。電鏡見培養(yǎng)細胞相互接觸后，接觸面細小絨毛減少，變?yōu)檩^粗的“殘枝樣”突起，而位于多個細胞間的細胞隨著與其它細胞及培養(yǎng)面實際接觸面積的減少，逐漸變圓，最后整個細胞逐漸脫離培養(yǎng)面成為脫落細胞，漂浮于培養(yǎng)液中，凋亡小體少見。予β-NGF后見細胞集落、密度和圓形深染細胞增多，細胞表面絨毛、微絨毛和纖毛變粗、變長，細胞內(nèi)微絲、微管增多、增大、增粗，較對照組明顯。細胞爬片IHC示：MIAPaca-2細胞中β-NGF、TrK

6、A及P75NGFR均有明顯表達，以TrKA表達最為明顯。MMP-2、E-cadherin也有不等量表達、分布。MTT和FCM示：β-NGF可促進MIAPaca-2細胞的增殖，主要是增加細胞周期中S期和G2/M期細胞的比例，而減少G0/G1期細胞的比例，各組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。高親和力受體TrKA抑制劑K252a則可抑制β-NGF對細胞的促增殖作用，各組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細胞劃痕實驗中，對照組過河時間為(68.4

7、5±3.53)h，β-NGF組過河實驗為(42.50±4.12)h，β-NGF組過河時間明顯縮短(P<0.01)。趨化侵襲實驗：隨著外源性β-NGF濃度的增加，MIAPaca-2細胞的侵襲和趨化能力均明顯增強，組問存在顯著性差異(P<0.05)。而K252a則呈濃度依賴性明顯抑制腫瘤細胞的趨化、侵襲能力，呈明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系。β-NGF可降低癌細胞間的黏附能力，促進運動遷移。成功建立了裸鼠皮下和原位移植瘤胰腺癌動物模型，皮下移植瘤無臟器

8、轉(zhuǎn)移，原位移植瘤在4W、6W和8W時均可見PNI，幾率分別為50％、80％和60％，并可見多種臟器轉(zhuǎn)移。6W原位移植瘤組織壞死少見、結(jié)構(gòu)清晰。病理解剖見部分受侵神經(jīng)組織大量密集分布。IHC、RT-PCR、RealtimePCR、Westembolt、基因測序等方法檢測結(jié)果示，6wks原位移植瘤組織中β-NGF、TrKA和P75NGFR的mRNA、蛋白表達量明顯增加，而E-cadmRNA、蛋白表達較對照組織明顯降低。原位瘤細胞β-NGF、

9、TrKA、P75NGFR、E-cadherin、MMP-2陽性表達，雙染見β-NGF和TrKA可同時表達，瘤細胞TrKA表達較多，神經(jīng)纖維β-NGF表達較多。瘤細胞超微結(jié)構(gòu)示表面的突起、微絨毛、纖毛明顯增多、變粗；細胞內(nèi)微絲、微管明顯變粗、變長。尤以伴PNI之原位瘤細胞為甚。β-NGF和TrKA基因測序結(jié)果經(jīng)NCBIBlast比對，發(fā)現(xiàn)β-NGF序列與Genbank中位于1P21-1p22.1的已知序列(AF411526)完全一致、Tr

10、KA與M23102完全一致。 結(jié)論：體內(nèi)、體外MIAPaCa-2細胞均同時表達β-NGF和TrKA，但以TrKA為主，說明癌細胞在體內(nèi)、體外生物學(xué)功能一致性。神經(jīng)細胞也可同時表達β-NGF和TrKA，但以β-NGF為主。癌細胞與神經(jīng)細胞TrkA、β-NGF同時雙相交互高表達，β-NGF和TrKA相互作用，通過信號傳遞，可能既可引起局部癌細胞增殖，也可引起癌細胞遷移運動，最終導(dǎo)致神經(jīng)浸潤。β-NGF可能通過促進MMP-2/9表達、