神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Artemin在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、研究背景：胰腺癌的發(fā)病率逐年上升，早期診斷困難，進(jìn)展迅速，預(yù)后極差。神經(jīng)侵襲是胰腺癌較為獨(dú)特的侵襲轉(zhuǎn)移方式，涉及腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)之間的信號(hào)相互作用。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)家族的四個(gè)成員及其相應(yīng)的受體在胰腺癌中都有不同程度的表達(dá)。其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Artemin能夠促進(jìn)多種不同神經(jīng)的生存，并具有軸突導(dǎo)向作用；Artemin還在胰腺癌、乳腺癌、

2、非小細(xì)胞肺癌和子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中存在異常表達(dá)，影響這些腫瘤的致瘤性和侵襲力。
　　 研究目的：從細(xì)胞水平、組織水平和動(dòng)物水平研究Artemin在胰腺癌生長(zhǎng)侵襲中的作用，探討靶向抑制Artemin蛋白表達(dá)對(duì)胰腺癌的潛在治療作用。
　　 研究方法：1.用Western blot法檢測(cè)11例胰腺癌及配對(duì)癌旁組織、6株胰腺癌細(xì)胞株的Artemin蛋白表達(dá)情況；用組織芯片免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)100例胰腺癌(60例導(dǎo)管

3、腺癌、40例腺鱗癌)的Artemin蛋白表達(dá)，分析其與各臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系；用生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(Growth associated protein43，GAP-43)IHC染色結(jié)合圖像分析計(jì)數(shù)胰腺間質(zhì)神經(jīng)纖維的數(shù)量和面積，分析Artemin蛋白表達(dá)與胰腺癌間質(zhì)神經(jīng)纖維肥大增生的關(guān)系。2.構(gòu)建Artemin真核表達(dá)質(zhì)粒和4種RNA干擾(RNAi)質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PancI細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Artemin過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和RNAi質(zhì)粒的單克隆株

4、，并利用Western blot法和qRT-PCR法篩選出過(guò)表達(dá)和RNAi效率最高的細(xì)胞株；用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期和AnnexinV法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)克隆形成試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、Transwell小室基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)等比較各組細(xì)胞克隆形成、遷移、侵襲等生物學(xué)行為；收集Artemin過(guò)表達(dá)細(xì)胞和RNA干擾細(xì)胞的培養(yǎng)液上清，處理PC12細(xì)胞，觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)和神經(jīng)元樣分化情況，比較各組癌細(xì)胞的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。3

5、.利用Artemin過(guò)表達(dá)和RNA干擾的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，建立裸鼠原位移植瘤動(dòng)物模型，觀察成瘤組織的人體和顯微鏡下特點(diǎn)，比較各組腫瘤大小、周圍器官侵犯、神經(jīng)侵犯、脈管癌栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況；GAP-43IHC染色結(jié)合圖像分析計(jì)數(shù)胰腺間質(zhì)神經(jīng)纖維的數(shù)量和面積，比較各組間質(zhì)神經(jīng)纖維肥大增生的情況。
　　 結(jié)果：1.胰腺癌組織中的Artemin表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，6株胰腺癌細(xì)胞株中都有不同程度的Artemin表達(dá)；免疫組化檢測(cè)表明

6、Artemin在胰腺癌組織中的陽(yáng)性率(71.0％)顯著高于癌旁組織(43.5％)，陽(yáng)性定位于癌細(xì)胞、癌旁管狀復(fù)合物、間質(zhì)神經(jīng)纖維及動(dòng)脈壁；Artemin在癌組織中的表達(dá)與胰腺癌的組織病理類型、性別年齡、部位、大小、分化程度和周圍器官侵犯等臨床病理學(xué)參數(shù)無(wú)關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)侵襲的發(fā)生有關(guān)；胰腺癌間質(zhì)中可見(jiàn)明顯的神經(jīng)病理學(xué)改變，包括神經(jīng)纖維肥大、增生及癌細(xì)胞侵犯神經(jīng)。Artemin陽(yáng)性組神經(jīng)纖維的平均數(shù)量(49.72±5.177/cm

7、2)和面積(0.328±0.058mm2)均顯著高于Artemin陰性組神經(jīng)纖維平均數(shù)量(28.72±4.248/cm2)和面積(0.0857±0.025mm2)。2.在胰腺癌細(xì)胞中持續(xù)過(guò)表達(dá)Artemin增加了癌細(xì)胞克隆形成、細(xì)胞遷移、基質(zhì)膠侵襲等能力，細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的神經(jīng)元樣分化；RNA干擾能夠顯著抑制癌細(xì)胞的克隆形成、遷移及侵襲力，細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)PC12的誘導(dǎo)分化作用也不明顯；Artemin過(guò)表達(dá)或抑制對(duì)胰腺癌細(xì)

8、胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡均無(wú)明顯影響。3.Artemin過(guò)表達(dá)細(xì)胞與空載體對(duì)照相比，能夠增加裸鼠原位移植腫瘤的大小，在體內(nèi)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞向周圍器官侵襲，增加神經(jīng)侵襲及脈管侵襲的幾率，并促進(jìn)癌旁神經(jīng)纖維增生；ArteminRNAi組細(xì)胞成瘤率降低、腫瘤體積更小，侵襲周圍器官的現(xiàn)象減少，神經(jīng)纖維數(shù)量減少，也未見(jiàn)脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及神經(jīng)侵犯現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：1.胰腺癌組織表達(dá)的Artemin蛋白參與了胰腺癌間質(zhì)中神經(jīng)肥大與增

9、生等病理改變，并與癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)侵襲的發(fā)生有關(guān)。2.胰腺癌細(xì)胞表達(dá)的Artemin在體外能夠促進(jìn)自身存活，增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲力，并通過(guò)旁分泌作用產(chǎn)生了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)屬性；ArteminRNAi能夠顯著抑制這些作用。3.在胰腺癌細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)Artemin蛋白能夠增加原位移植瘤的體積，促進(jìn)移植瘤向周圍器官、脈管及神經(jīng)侵襲，刺激間質(zhì)神經(jīng)纖維增生；靶向抑制Artemin表達(dá)對(duì)胰腺癌生長(zhǎng)侵襲具有明顯的抑制作用，可能成為胰腺癌治療的潛