TMEM45B在胰腺癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡中的機(jī)制研究.pdf

1、目的：胰腺癌（pancreatic cancer）是一種死亡率極高的惡性消化道腫瘤。因患者被診斷時往往已經(jīng)處于晚期，甚至大部分患者已發(fā)生鄰近器官的浸潤或是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而喪失了最佳治療時機(jī)而致其5年生存期低于6%。因此胰腺癌的早期診斷對其采取相應(yīng)的治療方案有著決定性的意義。腫瘤細(xì)胞的生成源于正常細(xì)胞的不規(guī)則生長，其與腫瘤基因的激活和抑瘤基因的失活有著密切的關(guān)系。但是鑒于影響胰腺癌的因素眾多，涉及的一系列的腫瘤基因、抑瘤基因和信號通路使得胰

2、腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍不甚明了。在以往諸多報道中TMEM（transmembrane proteins）家族成員與各種腫瘤的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。而最近興起的TMEM家族中 TMEM45B與腫瘤的相關(guān)報道至今仍未見報道。因此本研究擬通過對中TMEM45B基因與胰腺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡予以探討，旨在了解TMEM45B在胰腺癌進(jìn)程中發(fā)揮的作用及機(jī)制，為胰腺癌的相關(guān)診療工作提供新思路。
　　方法：在前期研究工作中，我們發(fā)現(xiàn) TMEM4

3、5B與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。因此本研究收集了2005～2013年45例經(jīng)病理學(xué)鑒定的外科手術(shù)切離的胰腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本，并使用qRT-PCR和免疫組化對45例組織中TMEM45B基因的表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行鑒定和檢測。同時本研究還以胰腺癌5種細(xì)胞系（BxPC-3、CFPAC-1、SW1990、Capan-1、和PANC-1）和一種正常胰腺細(xì)胞系HPDE6-C7為對象使用qRT-PCR和WB進(jìn)行mRNA和蛋白水平的檢測，并隨后以高表

4、達(dá)TMEM45B的兩種細(xì)胞系（SW1990和PANC-1）進(jìn)行后續(xù)功能研究實(shí)驗(yàn)的實(shí)施對象。為了進(jìn)一步研究 TMEM45B在腫瘤進(jìn)程中的功能，本研究使用基因富集分析技術(shù)（Gene set enrichment analysis，GSEA）對TMEM45Bhigh和TMEM45Blow細(xì)胞系與細(xì)胞周期相關(guān)基因和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的相關(guān)性進(jìn)行分析。為了進(jìn)一步證明TMEM45B對細(xì)胞周期和腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，本研究選用SW1990和 PANC-1兩種

5、細(xì)胞系，并設(shè)計pLKO.1-C1/sh-TMEM45B進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白中的3個核心蛋白（PCNA、CDK1和 CDC25A）以及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白中的3個核心蛋白（RAB1A、MAP4K3和NME2）行WB檢測，并對其基因表達(dá)水平行qRT-PCR檢測。為了證明TMEM45B基因?qū)υ鲋车挠绊懀狙芯糠謩e通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評估：1）對SW1990和PANC-1兩種細(xì)胞系轉(zhuǎn)染sh-TMEM45B，在隨后的24h、48h和72h

6、通過對細(xì)胞相對數(shù)量的檢測進(jìn)行評估；2）本研究為了較為明顯的觀察腫瘤生長狀況，選用了增殖速度較快的細(xì)胞系SW1990同時并構(gòu)建了相應(yīng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，并以此細(xì)胞系接種裸鼠，12d后觀察并測量腫瘤組織體積大小及重量。為驗(yàn)證 TMEM45B對細(xì)胞周期的影響，本研究分別轉(zhuǎn)染sh-TMEM45B入SW1990和PANC-1細(xì)胞系，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析TMEM45B對細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。同時我們還使用transwell對侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)行檢測。<

7、br>　　結(jié)果：本研究通過對45例胰腺癌的臨床組織標(biāo)本行免疫組化和WB檢測，結(jié)果也驗(yàn)證了 TMEM45B在胰腺癌組織中其 mRNA和蛋白水平均顯著高于癌旁組織（P<0.01）。與此同時我們還對5種細(xì)胞系（BxPC-3、CFPAC-1、SW1990、Capan-1和PANC-1）和一種正常胰腺細(xì)胞系HPDE6-C7為對象進(jìn)行mRNA和蛋白水平的檢測，結(jié)果顯示SW1990和PANC-1兩種細(xì)胞系TMEM45B表達(dá)水平較高，遂入選并作為后期的

8、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。為進(jìn)一步研究TMEM45B在腫瘤中的作用，本研究成功設(shè)計了pLKO.1-C1/sh-TMEM45B，并使用GSEA手段分析TMEM45B與腫瘤細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)移直接相關(guān)。隨后，我們通過sh-TMEM45B干擾TMEM45B表達(dá)，并對細(xì)胞周期相關(guān)的核心蛋白及轉(zhuǎn)移相關(guān)核心蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示干擾后核心蛋白相對含量均較干擾前顯著下降（P<0.01）；在TMEM45B對細(xì)胞增殖的研究數(shù)據(jù)顯示，兩種細(xì)胞系中sh-TMEM45B干擾組體外細(xì)

9、胞增殖水平在24h、48h以及72h均顯著低于同一時間點(diǎn)的未處理組（P<0.01），體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同樣顯示，干擾組裸鼠腫瘤組織體積及重量顯著小于未處理組（P<0.01）；而細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞系的sh-TMEM45B干擾組其G1期細(xì)胞比例較未處理組顯著升高（P<0.01），而S期比例顯著下降（P<0.01），對G2期無明顯影響，而過表達(dá)TMEM45B組，其G1、S1和 G2較未處理組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；sh-TMEM45

10、B干擾能夠顯著的增加細(xì)胞的凋亡，而過表達(dá)使得細(xì)胞凋亡減少，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示其對早期凋亡的影響尤為顯著（P<0.01），并且WB初步證明其凋亡與Bax和Caspase3蛋白高表達(dá)相關(guān)。同時對TMEM45B在侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)降低侵襲性也隨之降低，表達(dá)升高其侵襲性也隨之升高。反之，本研究選擇 TMEM45B表達(dá)水平較低的CFPAC-1細(xì)胞系，并使用慢病毒使CFPAC-1高表達(dá)TMEM45B，隨之對細(xì)胞系增殖能力、侵襲能力、抗凋亡

11、能力及細(xì)胞周期進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，過表達(dá) TMEM45B的CFPAC-1細(xì)胞其增殖能力在24h、48h、72h時均顯著高于對照組；同時過表達(dá)TMEM45B組其凋亡比例顯著低于對照組；transwell實(shí)驗(yàn)亦證明了過表達(dá)TMEM45B使得胰腺癌細(xì)胞侵襲力顯著提升；同樣 TMEM45B也影響 CFPAC-1細(xì)胞周期，即G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例升高。
　　結(jié)論： TMEM45B作為一種膜蛋白分子，其通過影響細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白