GPR137對胰腺癌生長侵襲轉(zhuǎn)移性影響及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行闡述：
　　第一部分 GPR137與胰腺癌的臨床相關(guān)性研究
　　研究目的：
　　通過對胰腺癌臨床相關(guān)性研究，分析比較在正常癌旁胰腺組織組織和胰腺癌組織中GPR137的表達(dá)情況
　　研究方法：
　　(1)免疫組織化學(xué)法比較了41例胰腺癌組織和癌旁胰腺組織，GPR137在胰腺癌和癌旁胰腺組織組織中的表達(dá)情況區(qū)別
　　結(jié)果：
　　(1) GPR137在胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中

2、的表達(dá)情況。20例呈陽性表達(dá)，1例呈弱陽性表達(dá)或無陽性表達(dá)。GPR137在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁胰腺組織。
　　結(jié)論：
　　本部分免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了GPR137在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁胰腺組織，實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然跟患者的年齡，性別，分期等沒有什么顯著性的差異，這可能由于樣本量少的原因。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中胰腺癌組織內(nèi)GPR137表達(dá)水平均出現(xiàn)上調(diào)，可以推斷GPR137在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要性。
　　第二部分

3、 GPR137-RNAi慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建和包裝
　　研究目的：
　　GPR137-RNAi慢病毒載體的構(gòu)建和包裝，沉默胰腺痛細(xì)胞中GPR137基因的表達(dá)，為接下來的GPR137在胰腺癌細(xì)胞中的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　(1)根據(jù)GenBank提供的GPR137的mRNA靶基因序列，設(shè)計(jì)并合成4對GPR137特異的siRNA。
　　(2)4組GPR137慢病毒敲減和過表達(dá)載體的構(gòu)建，并分別測序

4、檢測。
　　(3)慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)，并通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率和滴度檢測。
　　結(jié)果：
　　(1)根據(jù)設(shè)計(jì)原則，成功設(shè)計(jì)并合成了4對針對GPR137基因的siRNA。
　　(2)成功地構(gòu)建了4組GPR137慢病毒敲減和過表達(dá)地載體。
　　(3) GPR137-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察，可見被病毒感染的細(xì)胞呈綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率大于90％，證明轉(zhuǎn)染成功。隨后滴度測定顯示細(xì)胞感染效率接近1

5、00％。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)根據(jù)網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)siRNA的軟件，遵循RNAi設(shè)計(jì)原則，最終以慢病毒為載體構(gòu)建了4條針對GPR137基因的干擾片段，并通過熒光檢測其轉(zhuǎn)染效率大于90％，滴度檢測為為1.0E+07 TU/ml，成功構(gòu)建了針對目的基因GPR137的慢病毒載體，為下一步GPR137基因的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三部分 GPR137在胰腺癌細(xì)胞中的功能表型研究
　　研究目的：
　　通過各種功能檢

6、測實(shí)驗(yàn)，檢測敲除GPR137后胰腺癌細(xì)胞功能表型的變化，確定GPR137與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的重要性。
　　研究方法：
　　(1)慢病毒感染實(shí)驗(yàn)，熒光觀察GPR137-RNAi慢病毒載體的感染效率。
　　(2)運(yùn)用qRT-PCR方法檢測GPR137-RNAi慢病毒載體在mRNA層面上對GPR137基因的敲減效率。
　　(3)運(yùn)用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測了敲除GPR137后胰腺癌細(xì)胞增殖情況的變化。
　　(4)運(yùn)用

7、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測了敲除GPR137后胰腺癌細(xì)胞克隆形成能力的變化。
　　(5)運(yùn)用流式細(xì)胞儀方法檢測了敲除GPR137后胰腺癌細(xì)胞周期的變化情況。
　　(6)運(yùn)用AnnexinⅤ和7-AAD對聯(lián)合染色檢測Lv-shGPR137對細(xì)胞凋亡情況的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)用構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)載體Lv-shCon和Lv-shGPR137去感染兩株人胰腺癌細(xì)胞BXPC-3及PANC-1，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在BXP

8、C-3中，慢病毒表達(dá)載體Lv-shCon和Lv-shGPR137的感染效率很高，達(dá)到90％以上;在PANC-1中，所構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體依然有很高的感染效率，約為80％左右。
　　(2) BXPC-3和PANC-1細(xì)胞在感染Lv-shGPR13748h后提RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測，GPR137敲減組比對照組的mRNA水平均降低了將近80％。
　　(3)在BXPC-3、PANC-1中進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，Lv-shGPR

9、137幾乎完全抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長。
　　(4)BXPC-3細(xì)胞感染Lv-shGPR137后稀釋成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察發(fā)現(xiàn)Lv-shGPR137可以明顯抑制BXPC-3細(xì)胞的克隆形成能力。
　　(5)用BXPC-3細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，BXPC-3細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生了明顯的變化，其處于G0/G1的細(xì)胞下降到細(xì)胞總數(shù)的50％左右，而處在S期的細(xì)胞數(shù)量則明顯上升，達(dá)到了35％，三組細(xì)胞處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量差異不大。

10、>　　(6) BXPC-3細(xì)胞在感染了Lv-shGPR137后，其活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，約占總數(shù)的8％，處于早期凋亡的的細(xì)胞數(shù)量上升不明顯，大約為細(xì)胞總數(shù)的17％，而晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量則急劇增多，接近70％。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了GPR137-RNAi的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染入胰腺癌細(xì)胞中，通過沉默胰腺癌細(xì)胞中的GPR137基因的表達(dá)，探究GPR137缺失前后胰腺癌細(xì)胞功能表型的變化，結(jié)果表明GPR137在胰腺癌細(xì)胞中能明顯抑

11、制細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。
　　第四部分 GPR137在胰腺癌細(xì)胞中的分子機(jī)制研究
　　研究目的：對可能調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制及促凋亡的分子機(jī)制和關(guān)鍵的蛋白的研究。
　　研究方法：
　　運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測抑制GPR137對胰腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況改變
　　結(jié)果：
　　在敲除GPR137的胰腺癌細(xì)胞中，PARP蛋白發(fā)生了活化，Caspase-3蛋白發(fā)生了上調(diào)，提示P

12、ARP和Caspase-3在抑制GPR137誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用。
　　結(jié)論：
　　在胰腺癌細(xì)胞中，抑制GPR137的表達(dá)后，PARP發(fā)生了明顯的裂解激活現(xiàn)象，而Caspase-3的表達(dá)也明顯增強(qiáng)，說明了胰腺癌細(xì)胞發(fā)生了明顯凋亡，并且可能是由于PARP的裂解激活和Caspase-3的上調(diào)所導(dǎo)致的。本實(shí)驗(yàn)對GPR137基因在胰腺癌中抑制細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制做了初步的探討，為尋找胰腺癌新的診斷標(biāo)