TFPI-2基因在胰腺癌中的表達及其在體內外對腫瘤生長、侵襲及轉移作用機制的研究.pdf

1、胰腺癌惡性程度最高的腫瘤之一，易侵犯神經、血管、淋巴管，加之解剖位置深在、隱蔽及早期缺乏特異性癥狀等特點，故現(xiàn)有檢查很難早期發(fā)現(xiàn)。而且，胰腺癌對現(xiàn)有的放療、化療又極為不敏感，手術切除率低(僅為15-30％)、轉移復發(fā)率高、預后差。因此，常規(guī)治療方法對胰腺癌的治療效果很不理想，積極探索新的治療方法，抑制胰腺癌的侵襲轉移，改善其預后已成為目前亟待解決的關鍵問題。得益于DNA重組技術的發(fā)展，腫瘤是基因異常持續(xù)積累結果的認可，針對惡性腫瘤所采取

2、的生物治療技術日趨成為腫瘤治療的重要手段之一。理論上通過細胞的基因治療，糾正相應的基因異常，可以逆轉腫瘤細胞的惡性屬性。體外實驗證明：將組織金屬蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)轉染胰腺癌細胞Panc-1后，可顯著抑制胰腺癌細胞裸鼠接種的成功率、接種瘤的生長、血管生成和轉移，并增加Panc-1細胞的凋亡率，并顯著延長裸鼠負瘤生存期。定位于人類染色體7q22的TFPI-2基

3、因，其編碼產物組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI-2)是廣譜絲氨酸蛋白酶抑制物，廣泛分布于人類肝、胰腺、腎、心、骨骼肌和前列腺等正常組織，體外可強烈抑制纖溶酶、胰蛋白酶，基質金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinases，MMP-1)和3(MMP-3)的活化，參與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的重塑過程，維持ECM的結構完

4、整，調控腫瘤細胞的侵襲轉移，在腫瘤細胞侵襲轉移等一系列生理和病理過程中扮演重要角色?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TFPI-2與多種腫瘤如神經膠質瘤、絨毛膜癌、黑色素瘤以及肺癌等的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。本研究構建TFPI-2基因的真核表達載體pEGFP-C1-TFPI-2，并將其轉染胰腺癌細胞系Panc-1細胞，檢測轉染細胞、正常胰腺組織和不同時期及不同分化胰腺癌組織中TFPI-2基因的表達，探討TFPI-2對胰腺癌細胞增殖、凋亡及體內和體外侵襲浸潤能力影響

5、及其可能的作用機制，為判斷胰腺癌的預后及其基因治療提供新的實驗依據。
　　 目的：本研究應用分子生物學、免疫學技術，構建穩(wěn)定表達TFPI-2的人TFPI-2基因真核表達載體pEGFP-C1-TFPI-2，將其轉染胰腺癌細胞系Panc-1細胞，觀察TFPI-2基因在胰腺癌細胞系Panc-1、正常胰腺組織和胰腺癌組織中的表達情況，測定并比較TFPI-2表達組與非表達組細胞的生長曲線，利用Boyden小室檢測TFPI-2表達組與非表達

6、組胰腺癌細胞的穿膜細胞數(shù)，比較TFPI-2表達組與非表達組胰腺癌細胞的裸鼠成瘤大小，以此作為評價胰腺癌細胞體外和體內侵襲浸潤能力的指標。利用DNA片段化分析檢測TFPI-2表達組與非表達組細胞凋亡率，研究TFPI-2的表達對胰腺癌細胞凋亡的影響。
　　 方法：⑴RT-PCR實驗：目的基因的擴增及轉染后TFPI-2 mRNA檢測；正常胰腺組織及胰腺癌組織中TFPI-2 mRNA檢測；⑵Western blot實驗：轉染前后TFPI

7、-2蛋白表達的檢測；正常胰腺組織及胰腺癌組織中TFPI-2 蛋白表達的檢測；⑶細胞培養(yǎng)及轉染：采用脂質體Lipofectamine2000介導；⑷Boyden小室侵襲實驗：觀察TFPI-2對胰腺癌細胞體外遷徙和浸潤能力的影響；⑸裸鼠皮下種植瘤模型建立：觀察TFPI-2對胰腺癌細胞裸鼠成瘤的影響及體內浸潤能力的影響；⑹細胞凋亡檢測：采用DNA Ladder帶凝膠電泳進行分析。
　　 結果：①成功構建了人TFPI-2基因真核表達載體

8、pEGFP-C1-TFPI-2；②Panc-1細胞無TFPI-2基因表達，脂質體Lipofectamine2000能介導真核表達載體pEGFP-C1-TFPI-2轉染Panc-1細胞，并使其穩(wěn)定表達TFPI-2 mRNA及相應蛋白；③TFPI-2能抑制胰腺癌細胞的體外侵襲能力；④TFPI-2能抑制胰腺腫瘤的生長及體內浸潤轉移；⑤TFPI-2能誘導胰腺癌細胞凋亡。
　　 結論：TFPI-2能顯著抑制胰腺癌細胞的體外、體內侵襲轉移能