YAP基因在胰腺癌遷移、侵襲及血管生成中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、胰腺癌，其主要的病理類型為胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic ductaladenocarcinoma, PDAC)，是惡性程度極高的消化道腫瘤，號(hào)稱“癌中之王”;五年生存率不足5％。由于肥胖、高脂飲食、糖尿病、吸煙、酒精依賴及慢性胰腺炎等原因，胰腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。胰腺癌起病隱匿，僅有15％-20％的病人獲得根治性手術(shù)機(jī)會(huì)，并且胰腺癌容易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移、對(duì)傳統(tǒng)放化療不敏感及治療方法的局限，造成其高死亡率。因此，深入研究胰腺癌的早

2、期轉(zhuǎn)移機(jī)制，探索新的治療方法顯得極其重要。
　　近年研究表明Hippo通路通過調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡參與器官發(fā)育、干細(xì)胞全能性維持等過程。最新研究表明Hippo通路在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮了重要作用。YAP(Yes associated proteinl，YAP)基因是Hippo通路中的最核心轉(zhuǎn)錄共激活因子。Hippo通路參與到一系列激酶的激活過程導(dǎo)致YAP在細(xì)胞漿中磷酸化降解;非磷酸化的YAP可以進(jìn)入到細(xì)胞核參與一系列的轉(zhuǎn)

3、錄因子激活過程，如TEADs、SMAD、RUNX和CTGF等。YAP基因還參與腫瘤干細(xì)胞維持、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)、遷移及侵襲和化療耐藥等多種腫瘤生物學(xué)行為。高表達(dá)的YAP在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮了重要作用。但目前對(duì)YAP如何調(diào)控腫瘤微環(huán)境、促進(jìn)腫瘤侵襲及血管生成的相關(guān)機(jī)制還不明確。
　　缺氧微環(huán)境廣泛存在于實(shí)體腫瘤中，并且和腫瘤侵襲、細(xì)胞外基質(zhì)(E

4、xtracellularmatrix，ECM)降解及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等密切相關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是缺氧通路最重要的轉(zhuǎn)錄因子，在胰腺癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。胰腺癌中HIF-1α高表達(dá)，并且和腫瘤侵襲、細(xì)胞外基質(zhì)降解及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等行為相關(guān)。YAP的活化也和細(xì)胞外基質(zhì)中的氧濃度密切相關(guān)。因此研究缺氧條件下Hippo通路如何調(diào)控胰腺癌的侵襲具有重要意義。
　

5、　維替泊芬（Veterporfin，VP）是臨床中應(yīng)用的光敏劑，主要用于治療年齡相關(guān)的黃斑變性。研究發(fā)現(xiàn)維替泊芬可以通過干擾YAP-TEAD復(fù)合體的形成，抑制Hippo通路相關(guān)蛋白表達(dá)。維替泊芬還可以通過抑制YAP表達(dá)，抑制腫瘤發(fā)生、侵襲及血管生成;但維替泊芬在胰腺癌中抗腫瘤的作用及機(jī)制尚不明確。因此深入研究維替泊芬的抗腫瘤機(jī)制，將為胰腺癌的治療提供新的思路。
　　本實(shí)驗(yàn)將研究YAP在胰腺癌中的表達(dá)分布，分析YAP表達(dá)與臨床病理指

6、標(biāo)問的關(guān)系，并深入探究YAP基因調(diào)控胰腺癌遷移、侵襲及血管生成的作用和機(jī)制;我們還將進(jìn)一步研究缺氧條件下Hippo通路失活的分子機(jī)制;同時(shí)我們也將研究Hippo通路抑制劑維替泊芬在胰腺癌中抗腫瘤的作用及機(jī)制;這將為胰腺癌靶向YAP的治療提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　第一部分 YAP在胰腺癌組織中的表達(dá)及其意義
　　研究目的:
　　本部分主要研究YAP在胰腺癌組織及癌旁組織中mRNA及蛋白表達(dá)水平;分析胰腺癌組織中YAP表達(dá)

7、和臨床病理指標(biāo)間的相關(guān)性，并分析YAP與胰腺癌病人術(shù)后預(yù)后之間的關(guān)系。
　　研究方法:
　　本實(shí)驗(yàn)獲得山東大學(xué)附屬山東省千佛山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，共在山東省于佛山醫(yī)院獲取19例胰腺癌手術(shù)標(biāo)本，所有胰腺癌病人已簽署知情同意書。同時(shí)利用胰腺癌組織芯片，分析YAP與胰腺癌病人術(shù)后預(yù)后之間的相關(guān)性。
　　1.YAP的mRNA及蛋白在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)檢測(cè):獲取胰腺癌新鮮冰凍標(biāo)本，利用qRT-PCR，Western Blo

8、t及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)YAP的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　2.胰腺癌中YAP表達(dá)水平和病人臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性分析:利用胰腺癌組織芯片，采用免疫組化檢測(cè)YAP表達(dá)水平，采用x2檢驗(yàn)分析胰腺癌組織及癌旁組織中YAP差異表達(dá)，并分析胰腺癌組織中YAP與病人臨床病理資料之間的相關(guān)性。
　　3.胰腺癌組織中YAP表達(dá)和病人術(shù)后預(yù)后之間的相關(guān)性:采用Kaplan-Meier分析繪制生存曲線，分析YAP表達(dá)水平和胰腺癌病人術(shù)后生存期

9、的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.胰腺癌中YAP的mRNA及蛋白在腫瘤組織中高表達(dá)。
　　2.在胰腺癌組織芯片中，我們發(fā)現(xiàn)63例腫瘤組織中有37例YAP在細(xì)胞核中高表達(dá)，和癌旁組織中YAP表達(dá)有明顯差異（P＜0.01）;并且胞核YAP的表達(dá)和胰腺癌的病理分化程度相關(guān)，和性別、年齡、腫瘤大小、位置、TNM分期及臨床分期無明顯相關(guān)性。
　　3.腫瘤組織中胞核YAP的高表達(dá)和不良預(yù)后呈正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　

10、1.胰腺癌腫瘤組織中YAP高表達(dá);并且胞核YAP的表達(dá)和病理分化程度相關(guān)。
　　2.胰腺癌中胞核YAP表達(dá)可以作為預(yù)示胰腺癌術(shù)后不良預(yù)后的指標(biāo)。并且將來有可能作為胰腺癌治療的一個(gè)新型潛在靶點(diǎn)。
　　第二部分 YAP基因在胰腺癌侵襲、遷移及血管生成中的作用及機(jī)制研究
　　研究目的:
　　體外實(shí)驗(yàn)研究YAP在胰腺癌遷移、侵襲及血管生成的作用和機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.選取常見五種胰腺癌細(xì)胞系(PAN

11、C-1、BxPC-3、SW1990、Mia PaCa-2、Panc02.03)及正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(HPDE6)，提取mRNA及總蛋白，用qRT-PCR及Western Blot的方法檢測(cè)YAP的表達(dá)水平;篩選出高表達(dá)YAP的細(xì)胞系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.胰腺癌細(xì)胞系PANC-1及BxPC-3分別轉(zhuǎn)染沉默質(zhì)粒shYAP，篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株;qRT-PCR及Western Blot檢測(cè)YAP表達(dá)水平;利用劃痕實(shí)驗(yàn)及 Transwel

12、l實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默YAP對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。
　　3.利用Western Blot檢測(cè)沉默YAP對(duì)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail及MMP2、MMP13的影響。
　　4.選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，分別沉默或過表達(dá)YAP;利用Transwell實(shí)驗(yàn)和小管形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)YAP對(duì)血管生成能力的影響:Western Blot檢測(cè)血管生成素2(Ang2)表達(dá)。
　　結(jié)果:

13、r>　　1.胰腺癌細(xì)胞系中YAP的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于HPDE6。
　　2.沉默表達(dá)載體shYAP可以有效抑制胰腺癌細(xì)胞中YAP的表達(dá);沉默YAP可以抑制胰腺癌的遷移及侵襲能力。
　　3.沉默YAP后E-cadherin表達(dá)水平升高，Vimentin、Snail、MMP2及MMP13表達(dá)水平降低。
　　4.沉默YAP減弱HUVECs小管形成能力，過表達(dá)YAP增加了HUVECs小管形成能力;且沉默YAP導(dǎo)致An

14、g2水平降低，過表達(dá)YAP誘導(dǎo)Ang2表達(dá)水平升高。
　　結(jié)論:
　　1.胰腺癌細(xì)胞系中YAP表達(dá)水平明顯升高。
　　2.YAP可以通過EMT及MMPs途徑重塑腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)胰腺癌的遷移及侵襲。
　　3.YAP通過調(diào)控Ang2的表達(dá)，影響胰腺癌的血管生成能力。
　　第三部分缺氧誘導(dǎo)YAP核轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致Hippo通路失活促進(jìn)胰腺癌的侵襲
　　研究目的:
　　本部分主要探討HIF-1α及YAP在胰腺癌

15、組織中表達(dá)的相關(guān)性;并深入研究缺氧微環(huán)境影響胰腺癌侵襲能力及Hippo通路的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.檢測(cè)19例胰腺癌組織標(biāo)本中HIF-1α的mRNA表達(dá)水平;采用Pearson檢驗(yàn)分析HIF-1α及YAP的mRNA表達(dá)水平間的相關(guān)性。
　　2.通過劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)缺氧對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響;qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白、MMP2及MMP13的表達(dá)水

16、平。
　　3.Western Blot檢測(cè)缺氧對(duì)Hippo通路相關(guān)蛋白影響;分別提取細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中蛋白，檢測(cè)缺氧對(duì)YAP表達(dá)水平及部位影響;進(jìn)一步通過激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)HIF-1α和YAP蛋白的表達(dá)和定位。
　　4.缺氧環(huán)境下，分別沉默HIF-1α及YAP，通過Transwell檢測(cè)對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力影響;qRT-PCR和Western Blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白、MMP2及MMP13的表達(dá)水平;Western Blo

17、t檢測(cè)Hippo通路相關(guān)蛋白變化。
　　結(jié)果:
　　1.胰腺癌組織中HIF-1α的mRNA高表達(dá)，并且和YAP的表達(dá)有相關(guān)性。
　　2.缺氧增強(qiáng)了PANC-1及BxPC-3的遷移及侵襲能力;缺氧條件下E-cadherin表達(dá)減少，Snail、Vimentin、MMP2及MMP13表達(dá)增加。
　　3.缺氧條件下，HIF-1α表達(dá)增加，pYAP表達(dá)減少，TEAD表達(dá)增加;缺氧增加了胞核YAP/胞質(zhì)YAP的比例。

18、>　　4.缺氧條件下，沉默HIF-1α或YAP抑制胰腺癌的侵襲;沉默HIF-1α或YAP誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)增加，Snail、 Vimentin、MMP2及MMP13表達(dá)減少;沉默HIF-1α后Hippo通路蛋白表達(dá)無明顯變化，然而沉默YAP可以明顯抑制YAP、pYAP、TEAD及HIF-1α的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.胰腺癌腫瘤組織中HIF-1α高表達(dá)，并且和YAP的mRNA水平呈正相關(guān)。
　　2.缺氧通過

19、調(diào)控EMT相關(guān)蛋白、MMP2及MMP13促進(jìn)胰腺癌的侵襲。
　　3.缺氧可以誘導(dǎo)YAP核轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致Hippo通路的失活。
　　4.缺氧條件下，YAP可以轉(zhuǎn)錄激活HIF-1α表達(dá)，通過EMT及MMPs介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境重構(gòu)，促進(jìn)胰腺癌的侵襲。
　　第四部分 Hippo通路抑制劑維替泊芬誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡和抑制血管生成的機(jī)制研究
　　研究目的:
　　通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究Hippo通路抑制劑維替泊芬對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋

20、亡和血管生成的影響，并探索相關(guān)分予機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度維替泊芬對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力影響;通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)維替泊芬對(duì)細(xì)胞周期影響;通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)維替泊芬對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。
　　2.通過透射電鏡、TUNEL染色及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)維替泊芬對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.Western Blot檢測(cè)不同濃度維替泊芬處理胰腺癌細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞周期蛋白cyclinD1和cy

21、clinE1，凋亡相關(guān)蛋白PARP、cleaved PARP、Bax及Bcl-2，Hippo通路YAP、pYAP及TEAD蛋白的影響。
　　4.通過Transwell、小管形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證維替泊芬對(duì)HUVECs的血管生成能力的影響，Western Blot檢測(cè)Ang2的表達(dá)。
　　5.通過Transwell、小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)維替泊芬對(duì)胰腺癌血管生成擬態(tài)的影響;Western Blot檢查血管擬態(tài)標(biāo)記物VE-cadherin、α-

22、SMA及MMP2的表達(dá)。
　　6.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證維替泊芬對(duì)胰腺癌皮下移植瘤細(xì)胞凋亡、血管形成及血管生成擬態(tài)的影響;免疫組化染色cyclinD1、cyclinE1、Ki67、Ang2、VE-cadherin、α-SMA、MMP2、CD31等指標(biāo):TUNEL染色檢測(cè)凋亡及PAS/CD31雙染檢測(cè)血管生成擬態(tài)。
　　研究結(jié)果:
　　1.維替泊芬能夠抑制細(xì)胞存活，并呈時(shí)間及濃度依賴;維替泊芬還可以抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)將胰腺癌細(xì)

23、胞阻滯在GI期，減少S期細(xì)胞。
　　2.維替泊芬可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。
　　3.維替泊芬抑制細(xì)胞周期蛋向cyclinD1和cyclinE1，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白cleaved PARP、及Bax表達(dá)增加，還可以抑制Hippo通路YAP、pYAP及TEAD蛋白的表達(dá)，呈濃度梯度依賴。
　　4.維替泊芬可以抑制HUVECs的血管生成能力，也可以抑制胰腺癌細(xì)胞的血管生成擬態(tài);維替泊芬抑制了Ang2、VE-cadherin、α-

24、SMA及MMP2的表達(dá)。
　　5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)維替泊芬處理組腫瘤瘤重、體積小于對(duì)照組;免疫組化示維替泊芬組cyclinD1、cyclinE1、Ki67、Ang2、VE-cadherin、α-SMA、MMP2、CD31表達(dá)減少，血管擬態(tài)減少，凋亡指數(shù)增加。
　　結(jié)論:
　　1.維替泊芬可以抑制細(xì)胞增殖，將其阻滯在G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　2.維替泊芬可以通過抑制YAP蛋白表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。<